[發明專利]底物親和力提高的脂肪酸AMP連接酶突變體及其應用

在審

• 申請號: 201610145880.0
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105779400A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 王旻;吳旻;王露璇;王世靜
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/76;C12P21/02;C12R1/465
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及兩種親和力提高的脂肪酸AMP連接酶突變體，屬于基因工程和酶工程領域。

背景技術

達托霉素是由玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)產生的環脂肽類化合物，這類 抗生素的生物合成是通過不依賴于核糖體的非核糖體肽合成酶(Non-ribosomalpeptide synthetase，NRPS)途徑完成的，它在體外對革蘭氏陽性微生物具有強大的抗菌活性。

達托霉素是從玫瑰孢鏈霉菌發酵液中分離得來，由13個氨基酸殘基組成，正常情況下， 玫瑰孢鏈霉菌發酵產生一組環脂肽類抗生素：A21978C1-3，達托霉素是A21978C1-3的衍生 物，在玫瑰孢鏈霉菌發酵過程中，加入外源性前體癸酸可提高達托霉素在發酵產物中的比重。 達托霉素生物合成的起始是通過脂肪酸AMP連接酶和癸酸相結合來啟動的。

目前國內提高達托霉素產量的研究主要集中在優化達托霉素發酵工藝以及對達托霉素 高產菌株的選育工作。國內關于達托霉素發酵工藝的研究已經較為完善。相比較于發酵工藝 較為完善的研究，國內對于達托霉素高產菌株的選育工作主要是通過誘變以及抗性篩選來尋 找達托霉素高產菌株或者是提高玫瑰孢鏈霉菌對癸酸的耐受性，通過增加癸酸的添加量來提 高達托霉素的產量由于誘變以及抗性篩選面臨隨機性高，周期較長等問題，因此在基因水平 上進行定向改造來提高達托霉素產量成為了近些年的研究熱點。對玫瑰孢鏈霉菌誘變育種與 基因的定向改造相結合的方式將成為未來構建達托霉素高產菌株的主要研究方法。

發明內容

本發明的目的在于玫瑰孢鏈霉菌脂肪酸AMP連接酶(DptE)的基因dptE進行定點突 變，得到親和力提高的DptE，并將該突變基因取代野生玫瑰孢鏈霉菌的dptE基因構建重組 玫瑰孢鏈霉菌以提高產物中達托霉素的產量。

本發明提供了兩種親和力提高的脂肪酸連接酶突變體，其氨基酸序列是SEQIDNO.4、 SEQIDNO.5所示的序列，突變體簡稱pAL296、pAL302。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體是將原有蛋白的氨基酸序列進行計算機模擬 進行同源模建，分子對接測定其和癸酸的親和力，并設計突變。

本發明還提供兩種表達所述突變體的基因工程菌。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌為大腸桿菌E.coliBL21，表達脂肪酸連 接酶突變體。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌以玫瑰孢鏈霉菌為宿主，表達生產達托 霉素。

本發明還要求保護編碼所述突變體的核苷酸序列，以及所述突變體和基因工程菌在達托 霉素生產方面的應用。

有益效果：相對于原有的脂肪酸連接酶而言，本發明的突變體pAL296、pAL302產生 的達托霉素產量均提高了，本發明的脂肪酸連接酶可在酸性條件下催化癸酸的磷酸化作用， 應用于達托霉素的生產方面。

附圖說明

圖1是脂肪酸AMP連接酶的核酸電泳圖譜。DNA由箭頭標出，DNA大小以kb為單位。

圖2展示利用WesternBlot鑒定分離到的脂肪酸AMP連接酶蛋白。

圖3展示利用HPLC檢測的野生菌達托霉素發酵圖。

圖4展示利用HPLC檢測的菌株DCE296達托霉素發酵圖。

圖5展示利用HPLC檢測的菌株DCE302達托霉素發酵圖。

具體實施方式

培養基：

種子培養基(g/L)：葡萄糖5，糊精15，蛋白胨10，酵母粉10，Ph7.0，115℃滅菌30min。

發酵培養基(g/L)：糊精10.62，酵母粉1.59，酪蛋白1.28，L-天冬氨酸1.5，硫酸鉀8， Ph6.5，121℃滅菌20min。

達托霉素產量測定：