[發明專利]一種檢測抑芽丹的試紙條及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201610145751.1
• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105785011B
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 陳黎;范子彥;馮靜;吳小勝;潘立寧;胡斌;唐綱嶺;劉惠民;曹東山;崔華鵬;王曉瑜
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院;國家煙草質量監督檢驗中心;北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N33/531;G01N33/532;G01N21/78
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明涉及抑芽丹的檢測，具體是一種用于檢測抑芽丹的膠體金試紙條，其特別適用于煙葉中抑芽丹殘留的檢測。

背景技術

抑芽丹又稱馬來酰肼，化學名稱為順丁烯二酰肼（Maleic Hydrazide，MH），是一種植物生長調節劑和選擇性除草劑。抑芽丹可阻礙植物細胞分裂和降低光合作用效率，因此常被用于抑制蔬菜如馬鈴薯、洋蔥和大蒜等貯藏期發芽，也用于煙草種植中控制煙葉腋芽的生長。有研究稱抑芽丹是一種誘變致癌劑，一定劑量下會導致細胞染色體斷裂，從而產生細胞毒性，因此抑芽丹殘留量日益受到關注。我國規定，大蒜、洋蔥、蔥中抑芽丹的最大殘留限量（MRL）為15 mg/kg，馬鈴薯中抑芽丹的MRL為50 mg/kg；國際食品法典規定，大蒜、洋蔥、蔥中抑芽丹的MRL為15 mg/kg，馬鈴薯中抑芽丹的MRL為50 mg/kg；歐盟規定大蒜中抑芽丹的MRL為15 mg/kg；美國規定，洋蔥中抑芽丹的MRL為15 mg/kg，馬鈴薯中抑芽丹的MRL為50 mg/kg；國際煙草科學研究合作中心（CORESTA）規定煙草中抑芽丹的指導性殘留限量（GRL）為80 mg/kg。

抑芽丹的殘留分析方法有多種：蒸餾分光光度法（AOAC）、高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）、高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS）、氣相色譜法、毛細管電泳法、極譜法等，另外也有流動注射法和脈沖伏安法等方法，其中最常用的是前3種分析方法。但是AOAC法對蒸餾裝置要求高，樣品前處理復雜，操作繁瑣，耗堿量大，儀器腐蝕嚴重；HPLC-UV法中抑芽丹很難與樣品中的干擾雜質分開，無法滿足實際樣品的檢測要求；使用HPLC-MS法測定抑芽丹的儀器成本則相對較高。因此，開發一種不受檢測設備限制并且能夠實現對大批量樣品進行快速檢測的產品和方法成為迫切需要解決的問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有的檢測抑芽丹的方法存在的對設備依賴性高，并且不能夠實現對大批量樣品的快速檢測的問題，提供一種操作簡單、靈敏度高、檢測速度快、成本低、不受檢測設備限制的試紙條及其制備方法和應用，以實現對大批量樣品中抑芽丹進行快速檢測和現場監控。

為了實現本發明的目的，本發明提供了一種檢測抑芽丹的試紙條，該試紙條包括樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊和底板；其中，所述反應膜上具有包被有抑芽丹半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線，所述結合物釋放墊上噴涂有抑芽丹單克隆抗體-膠體金標記物；所述抑芽丹半抗原-載體蛋白偶聯物由抑芽丹半抗原與載體蛋白偶聯得到；所述抑芽丹單克隆抗體是以抑芽丹半抗原-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得。

所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白或人血清白蛋白。

所述抑芽丹半抗原是由磺酸基馬來酸酐與硫酸肼反應生成磺酸基抑芽丹，再與3-羥基丙酸反應得到，其分子結構式為：

所述羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對山羊進行免疫制備獲得。

所述樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊依次粘貼在底板上，所述結合物釋放墊1/3~1/2被覆蓋于樣品吸收墊下。

所述底板為PVC底板或其他硬質不吸水的材料；所述樣品吸收墊為吸濾紙或濾油紙；所述結合物釋放墊為玻璃棉或聚酯材料；所述吸水墊為吸水紙；所述反應膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。

一種制備上述試紙條的方法，包括以下步驟：

1）制備噴涂有抑芽丹單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊；

2）制備具有包被有抑芽丹半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線的反應膜；

3）將1）和2）制備好的結合物釋放墊、反應膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成試紙條。

具體地說，步驟包括：

1）將磺酸基馬來酸酐與硫酸肼反應生成磺酸基抑芽丹，再與3-羥基丙酸反應，制備抑芽丹半抗原；

2）將抑芽丹半抗原與載體蛋白偶聯，制備抑芽丹半抗原-載體蛋白偶聯物；

3）用抑芽丹半抗原-載體蛋白偶聯物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞通過融合、篩選，得到分泌抑芽丹單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；

5）分別將抑芽丹半抗原-載體蛋白偶聯物和羊抗鼠抗抗體包被于反應膜的檢測線（T）和質控線（C）上；

6）用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金；

7）將制備的抑芽丹單克隆抗體加入到制備的膠體金中，得到抑芽丹單克隆抗體-膠體金標記物；