[發明專利]牛支原體MbovP730蛋白在自然感染和疫苗免疫鑒別中的應用

有效

• 申請號: 201610144587.2
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN107176977B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 郭愛珍;趙剛;郭雨絲;劉凱;張慧;陳曦;陳穎鈺;胡長敏
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C07K14/30
• 分類號: C07K14/30;C12N1/21;G01N33/68;G01N33/569;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

本發明屬于動物傳染病防治技術領域，具體涉及牛支原體MbovP730蛋白在自然感染和疫苗免疫鑒別中的應用。根據大腸桿菌的密碼子偏愛性，對M.bovis HB0801的Mbov_730基因進行克隆，將Mbov_730基因修飾，將牛支原體色氨酸密碼子UGA突變成大腸桿菌中的色氨酸密碼子UGG，進而在大腸桿菌中表達重組的牛支原體MbovP730蛋白。本發明的MbovP730蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示,該蛋白可作為抗原蛋白在制備鑒別診斷牛支原體野毒株感染和疫苗株免疫鑒別試劑盒中的應用。

技術領域

本發明屬于動物傳染病防治技術領域，具體涉及一種牛支原體MbovP730蛋白及其應用。經過純化后的蛋白可以作為抗原蛋白在制備鑒別診斷野毒株Mycoplasma bovisHB0801感染和疫苗株Mbov HB0801-150.2免疫試劑盒中的應用。

背景技術

牛支原體(Mycoplasma bovis,M.bovis)是肉牛和奶牛的重要病原微生物，是導致我國肉牛呼吸綜合征、運輸應激綜合征和奶牛乳腺炎的主要病原體，臨床癥狀主要表現為肺炎，乳腺炎、關節炎，還可表現為中耳炎、結膜炎和生殖道炎癥等多種癥狀。牛支原體于1961年首次在美國發現，從患乳房炎奶牛的牛奶中分離得到。1976年證實其是導致肺炎的重要病原體。此后發現，牛支原體肺炎和乳腺炎在全世界廣泛流行(Caswell等，2010；White等，2010)。據估計，歐洲每年約有25％～33％的犢牛肺炎是由牛支原體引起的，相當于每年損失1.44～1.92億歐元,其中英國每年就有190萬頭牛患牛支原體肺炎，死亡達15.7萬頭。美國牛場牛支原體感染率可達70％，每年因牛支原體肺炎和乳腺疾病所造成損失也達1.40億美元。

隨著我國養牛業向規模化和集約化發展，牛養殖量大大增加，專門化程度大幅度提高，肉牛“異地育肥”已成為重要的肉牛養殖模式。長距離運輸是“異地運輸”的重要環節，運輸應激可誘發多種重要疫病，牛支原體肺炎就是其中一種。該病2008年在湖北省首次報道(石磊等，2008)，從外地引進肉牛，在引進后2周左右發病，表現為發熱，咳嗽，流鼻涕，犢牛和體質弱的牛發病嚴重。發病率為50％～100％。臨床治療周期長，效果差，病死率平均10％，可高達60％，主要病理變化為肺實變、化膿或干酪樣壞死，給我國養牛業帶來了巨大損失。繼2008年首次報道后，不同研究者均證實該病在全國廣泛流行(辛九慶等，2008；胡長敏等，2009)。

牛支原體無細胞壁，對常用β內酰胺類抗生素不敏感，對其它藥物如四環素、大環內脂類和氟喹酪酮類等敏感藥物也很容易產生耐藥性(Mustafa等,2013)。由于抗生素的不敏感，疫苗被認為是預防牛支原體病的有效措施。申請者先前將牛支原體野毒株(Mycoplasma bovis HB0801)在體外連續傳代150代獲得疫苗株Mbov HB0801-150.2，經過牛體驗證該疫苗株免疫后對牛支原體野毒株攻擊具有良好的抵抗力(Zhang等，2014)。

對M.bovis HB0801(GenBank登錄號：CP002058)和Mbov HB0801-150.2的全基因組序列解析(Qi等,2012)發現，Mbov HB0801-150.2較M.bovis HB0801缺失了長為14kb的DNA片段，這為Mbov HB0801-150.2免疫和M.bovis HB0801感染的區分提供了良好的分子標識。對缺失DNA片段中的基因進行克隆表達，利用感染血清和疫苗免疫血清進行平行檢測，篩選發現一個能區分牛支原體野毒株感染和疫苗免疫的鑒別診斷標識分子MbovP730。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，其第一個目的是提供一個可以鑒別診斷牛支原體野毒株(M.bovis HB0801)感染和牛支原體疫苗株(Mbov HB0801-150.2)免疫的分子標識牛支原體MbovP730蛋白。

本發明的另一個目的在于提供一種牛支原體MbovP730蛋白的抗體檢測方法，組裝用于區分牛支原體野毒株感染和牛支原體疫苗株ELISA試劑盒中的應用。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術方案：