[發明專利]一種用于骨癌檢測的適配子及其試劑盒

在審

• 申請號: 201610143614.4
• 申請日: 2016-03-13
• 公開（公告）號: CN105755005A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 曹帥
• 申請（專利權）人: 曹帥
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/574;G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種用于骨癌檢測的適配子及其試劑盒。

背景技術

骨癌(Osteosarcoma)，其是一種由骨骼系統長出的惡性腫瘤，且為骨腫瘤中最常見的一種，會侵犯鄰近的組織及器官，也可能會轉移至遠處的其它器官，好發于年紀介于十歲至二十歲之間的小孩及青少年身上，且男性發生幾率略高于女性。骨癌的致病原因迄今未明，由它的原發部位和多發生于快速生長的年紀，顯示其跟成骨細胞的活性增加可能有關，而遺傳因素在骨癌似乎也扮演一個角色，此外也可能與慢性發炎、輻射或病毒感染有關。

目前針對骨癌的檢測一般都是都是抽血采用膠體金技術進行檢測，比如CN103267856B中公開的試紙檢測，但是該檢測方法具有一定的局限性，檢測濃度有限制，并且準確性也有待提高。

SELEX技術是20世紀90年代初發展起來的一種新的組合化學技術。利用該技術可以從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選到特異性與靶物質高度親和的核酸適配體。其基本思路是體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，與靶物質混合，形成靶物質-核酸復合物，洗脫未結合的核酸，分離與靶物質結合的核酸分子，并以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進入下輪的篩選。通過重復的篩選與擴增，一些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中親和力的核酸分子被洗去，而與革G物質有強親和力的核酸分子從非常大的隨機庫中分尚出來，且純度隨SELEX過程的進行而增高，最后占據庫的大多數(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先運用此技術篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異核酸適配體后，經過十幾年的發展，SELEX技術已經成為一種重要的研宄手段和工具。因此，采用selex技術，篩選特定的結合骨癌細胞的適配體具有較為重要的意義。

發明內容

本發明的技術方案通過以下步驟實現：

本發明的目的是提供一種骨癌細胞的核酸適配體序列。

本發明中，所述的骨癌細胞的核酸適配體(序列1-29)能夠特異結合骨癌細胞細胞。

本發明中，所述的骨癌細胞選自骨髓瘤細胞株XG7細胞。

本發明的進一步的目的是提供所述核酸適配體序列的用途。本發明中根據對該序列應用，可進一步用于制備特異性分離人骨髓瘤細胞株XG7的試劑盒。

從體外合成的隨機寡聚DNA文庫，5’-ATTCGACATGCCTGGACATA(N36)CATGCCACATGACCAAGGCA-3’。中篩選出與骨髓瘤細胞株XG7特異結合的核酸適配體；將篩選出的序列用引物F(5，-FAM-ATTCGACATGCCTGGACATA-3，)和R(5，-biotin-TGCCTTGGTCATGTGGCATG-3’)進行擴增并進行TA克隆入pMD19-T載體(購自上海博光生物公司)，轉化DH5a細菌(購自北京天根生物公司)；挑去白色菌落進行PCR確定陽性克隆后，抽提質粒并測序反應，上測序儀測序。

本發明采用核酸適配體的體外篩選(SELEX)技術，以骨髓瘤細胞株XG7為正篩靶標，以人骨髓間充質干細胞為反篩靶標，篩選與骨髓瘤細胞株XG7特異結合的核酸適配體，制得具有特異結合骨髓瘤細胞株XG7的序列，本發明中命名為適配體GSL1-GSL29。序列如下：

GSL1：

TCGACATGCCTGGACATATAACCCCCCTTCTCAAACAATATTCAAATTTCTATACATGCCACATGACCAAGGCA

GSL2：

ATTCGACATGCCTGGACATACCTTTTAACACAACCTACCTTCTTTCCTACACATCCCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL3：

ATTCGACATGCCTGGACATAAACCACATTAATACATCTTATAATTATTCTTACTACCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL4：

ATTCGACATGCCTGGACATATATCACACTACATTATATTCTTCTCCACCCTTATCTCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL5：

ATTCGACATGCCTGGACATACTTAAAATACACCCTAAATTCTTACATAAATAACAACATGCCACATGACCAAGGCA

GSL6：

ATTCGACATGCCTGGACATACTCAAATAATCACTTATACAAAAAAACTCTATTTTTCATGCCACATGACCAAGGCA