[發明專利]一種利用分子標記快速轉育獲得橙紅色穎殼水稻育種材料及其轉育方法

在審

• 申請號: 201610142432.5
• 申請日: 2016-03-14
• 公開（公告）號: CN105684889A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 蒲志剛;馮俊彥;張志雄;張志勇;王平;白玉路;向躍武;蔡平鐘
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院生物技術核技術研究所
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;C12Q1/68
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 李蕊

1.一種利用分子標記快速獲得橙紅色穎殼水稻育種材料的方法，其特征在于，包括以 下步驟：

（1）材料準備：選取待轉育成橙紅色穎殼性狀的水稻材料為母本，具有橙紅色穎殼性狀 的水稻材料為父本，分別播種育苗；

（2）雜交處理：選取即將開花的母本，去雄套袋，待雌蕊成熟之后，取父本花粉，授予已 去雄的母本雌蕊柱頭上后套袋；

（3）分子標記選擇：選取飽滿的雜交種子，消毒后用無菌水沖洗干凈，催芽培養，然后取 其葉片提取DNA，以橙紅色穎殼性狀基因分子標記進行PCR擴增和凝膠電泳檢測，選擇含有 橙紅色穎殼性狀基因，且標記呈雜合狀態的植株進行培育，在后代中選擇性狀偏向母本的 材料重復（1）、（2）、（3）步驟4-5次；

其中所述分子標記篩選的具體步驟為：

1）PCR擴增體系：反應總體系為20μL，分別含有100ng水稻基因組DNA，1×buffer，1.5 mMMgCl₂，200μMdNTP，0.25μM引物，0.5UTaq酶；

引物為：

S1：F(5'-3')CCCTCCGTCTCAACACTCTG；

R(5'-3')GCAATCTGCTTGTACTTCTC；

S2：F(5'-3')TATACCAAAACTAGGTTAAAAC；

R(5'-3')GCACTCCGAACTCTGAAA；

2）PCR擴增；

3）電泳檢測：2.5%瓊脂糖凝膠電泳或6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；

（4）幼苗培養：將步驟（3）中選擇的種子催芽、育苗然后套袋自交，自交后的種子繼續催 芽育苗后，取葉片提取DNA，以橙紅色穎殼性狀基因分子標記進行篩選，選擇含有純合橙紅 色穎殼性狀基因，且標記呈純合狀態的植株，催芽、育苗培育；

（5）選擇橙紅色穎殼水稻育種材料：待步驟（4）的幼苗抽穗后，持續觀察穎殼變化，并與 原始母本材料對比，選擇具有橙紅色穎殼性狀的植株。

2.根據權利要求1所述的一種利用分子標記快速獲得橙紅色穎殼水稻育種材料的方 法，其特征在于，步驟（3）中的消毒過程是先使用70%酒精消毒后再用濃度為5%~15%的次氯 酸鈉溶液消毒。

3.根據權利要求1所述的一種利用分子標記快速獲得橙紅色穎殼水稻育種材料的方 法，其特征在于，步驟（3）中PCR擴增程序為94℃預變性5min，94℃變性45s，57℃退火30s， 72℃延伸1min，40個循環，最后72℃終延伸10min，冷卻至12℃保存。

4.根據權利要求1所述的一種利用分子標記快速獲得橙紅色穎殼水稻育種材料的方 法，其特征在于，步驟（3）中2.5%瓊脂糖凝膠電泳過程為：2.5%瓊脂糖凝膠，加入5μL/100mL 的溴化乙錠，于1/2×TBE緩沖液中，120V電泳2h。

5.根據權利要求1所述的一種利用分子標記快速獲得橙紅色穎殼水稻育種材料的方 法，其特征在于，步驟（3）中6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳過程為：向PCR產物中加入5μL上 樣緩沖液、6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，然后向電泳槽上加入1×TBE緩沖液，100W恒定功率 預電泳25分鐘之后停止，點樣5μL，90W恒定功率電泳1.2小時后在固定液中固定20分鐘，然 后用雙蒸水清洗2次，最后至于銀染液中染色30分鐘，接著用雙蒸水清洗后放入顯影液中至 條帶完全顯現出來；其中上樣緩沖液由質量分數40%蔗糖和0.025%溴酚藍組成。

6.根據權利要求1-5任一項所述的方法培育出的橙紅色穎殼水稻育種材料。