[發明專利]一種可有效提高蛋白分泌表達效率的信號肽及其應用

有效

• 申請號: 201610142029.2
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105601720B
• 公開（公告）日: 2019-04-30
• 發明（設計）人: 應漢杰;徐煜;陳勇;朱杰;柳東;牛歡清;吳菁嵐;朱晨杰;莊偉
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/11;C12N1/21;C12N15/70;C12N15/67;C12N9/16;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

本發明公開了一種介導蛋白質分泌表達的信號肽，屬于蛋白質工程和基因工程領域。通過對已知的信號肽PelB和OmpA進行改造，其N端具有信號肽OmpA的前三個氨基酸殘基MKK；C端具有信號肽OmpA的后三個氨基酸殘基AQA；而中間的疏水結構則是信號肽PelB的疏水序列LLPTAAAGLLLLAAQP。本發明所述的可有效提高蛋白分泌效率的信號肽，使用后顯著的提高了菌株的對目的蛋白的分泌表達能力，本發明中可將目標蛋白磷脂酶D的胞外酶活提高2倍，改造后的菌株胞外產酶能力顯著提高，更利于工業化應用。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種可有效提高蛋白分泌表達效率的信號肽及其應用。

背景技術

磷脂酶D(EC3.1.4.4)是一種特殊的酯類水解酶，它能催化水解磷脂分子中的磷酸和有機堿(如膽堿，乙醇胺等)羥基成酯的鍵，即4倍磷脂鍵。除水解作用外，在特定條件下還能催化各種含羥基的化合物結合到磷脂的堿基上，形成新的磷脂，這一特性被稱為磷脂酶D的磷脂轉移特性，也通常稱作堿基交換反應。利用這一特性可以對磷脂進行改性，從而制備高純度的單一磷脂和稀有磷脂，具有十分重要的研究價值。

但是磷脂酶D在自然界生物體中的含量往往極低，切提取工藝復雜，因此研究人員利用微生物易培養，成本低等特點，對微生物產磷脂酶D進行了廣泛的研究。大腸桿菌更是成為了磷脂酶D高效表達的一個重要的宿主菌。

在大腸桿菌中目的蛋白原則上可以被以下幾種方式生產：1，可溶性蛋白的胞內生產；2，包涵體蛋白的胞內生產；3，分泌至周質空間或直接至胞外培養基中。胞內生產可溶性蛋白時，要想獲得目的蛋白，往往需要進行超聲破碎，然后對目的蛋白進行純化，操作工藝十分的復雜。并且由于大腸桿菌是原核生物，其胞內缺乏蛋白折疊過程中的相關輔因子，因此當目的蛋白在其胞內大量表達時往往容易形成包涵體沉淀，這更加加大了對目的蛋白進行處理的難度。但是如果目的蛋白能過跨過內膜而定位于周質空間，或者直接分泌到胞外，這將會極大的簡化下游復性及分離純化工藝，減少目的蛋白對宿主菌的毒性，顯著提高表達量。

在大腸桿菌中實現目的蛋白的分泌表達要借助信號肽的介導。信號肽是一類具有15-60氨基酸的多肽，一般定位于分泌蛋白的N端。利用信號肽實現目的蛋白的分泌表達一般是將編碼目的蛋白的基因序列克隆到信號肽序列的后端，從而在宿主菌中實現目的基因和信號肽序列在轉錄和翻譯水平的融合。信號肽引導整個多肽鏈與胞內分子伴侶或者分泌信號識別位點相結合，進而跨膜轉運至胞外。

雖然大腸桿菌的分泌表達已經得到了廣泛關注，信號肽的種類也比較多，但是這些信號肽序列在用于在大腸桿菌中表達磷脂酶D時，沒有能取得較好的技術效果。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，提供一種可有效提高蛋白分泌表達效率的信號肽序列。

本發明還要解決的技術問題是，提供上述信號肽在蛋白分泌表達中的應用。

本發明還要解決的技術問題是，提供一株分泌表達磷脂酶D的大腸桿菌基因工程菌。

本發明最后要解決的技術問題是，提供上述分泌表達磷脂酶D的大腸桿菌基因工程菌的構建方法及應用。

技術方案：一種介導蛋白質分泌表達的信號肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

編碼權上述介導蛋白質分泌表達的信號肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述介導蛋白質分泌表達的信號肽在提高蛋白分泌表達效率中的應用。

一株分泌表達磷脂酶D的基因工程菌，它是在磷脂酶D基因的5’端克隆了SEQ IDNO：2所示核苷酸序列。

其中，所述的磷脂酶D基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

上述分泌表達磷脂酶D的基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：