[發明專利]一種基于Ion Torrent測序平臺的乳腺癌基因BRCA的DNA文庫構建方法

在審

• 申請號: 201610140822.9
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105696089A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 杜寶珠;蔡樂靖;錢飛箭;盧靈瀟;丁志遠;陳幗婧;陳賢豐
• 申請（專利權）人: 浙江圣庭生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/08;C12Q1/68
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

技術領域

本發明涉及基因測序領域，特別是高通量測序領域，具體是一種基于IonTorrent 測序平臺的乳腺癌基因BRCA1和BRCA2的DNA文庫構建方法。

背景技術

新一代高通量基因檢測技術，當今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和 Life公司的IonTorrent^TM系列測序儀為代表，有著其他技術不可比擬的高通量、低成本等 優勢。已被廣泛用于各類生物學研究和醫學檢測。在基因組水平上對還沒有參考序列的物 種進行重頭測序，獲得該物種的參考序列，為后續研究奠定基礎。對有參考序列的物種，進 行全基因組重測序，在全基因組水平上檢測突變位點，發現個體差異的分子基礎。新一代測 序技術通過全基因組測序構建了大量常規物種的基因組圖譜，也促進了測序技術的高速發 展。但全基因組結構復雜，周期長，費用高，限制了它的發展。

同時，高通量測序技術在基因診斷和基因治療方面也有重要作用。某些疾病的易 感基因通常只占基因組的很小一部分，對這些易感基因的研究并不需要對全基因組進行測 序，而只需要對特定的幾個基因進行研究。目標序列捕獲測序技術的出現，使得對基因組特 定區域的研究成為可能。這項技術首先合成大量能與基因組特定區域互補結合的寡聚核苷 酸序列，通過PCR擴增富集目標區段，然后用高通量測序技術對這些區段進行測序。與全基 因組測序相比，特定疾病易感基因測序費用更低，測序深度更高，測序結果更加精確，還可 以檢測到低頻突變。

根據現有報道：BRCA1/2基因突變在遺傳性乳腺癌患者中占有很大的比例(40％ ～45％)，且存在于80％的乳腺癌高發家族的患者中。攜帶BRCA1或BRCA2基因突變的人具有 較高的患有遺傳性乳腺癌和卵巢癌綜合征的風險。乳腺癌相關基因BRCA1和BRCA2測序就是 通過設計BRCA1與BRCA2基因區域的引物，通過多重PCR擴增，將目標區域DNA富集后進行高 通量測序。采用BRCA1和BRCA2基因測序，研究者可以對乳腺癌相關基因BRCA1和BRCA2進行 重點研究。這種高針對性的方法可以高效的發現，驗證和篩選BRCA1和BRCA2基因變異。相比 全基因組測序，乳腺癌相關基因測序對目標區域BRCA1和BRCA2基因有更準確快速的研究， 適用于針對大量樣本的檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于IonTorrent測序平臺的乳腺癌基因BRCA的DNA 文庫構建方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種基于IonTorrent測序平臺的乳腺癌基因BRCA的DNA文庫構建方法，具體步驟 如下：

(1)目標區域擴增：將待測樣本的DNA以及多重PCR引物，經多重PCR反應，得到第一 樣本；

(2)引物清除：取第一樣本與引物清除試劑混合進行反應，得到第二樣本；

(3)接頭連接：將第二樣本與接頭P1進行接頭連接反應，得到第三樣本；

(4)磁珠純化：將第三樣本進行磁珠純化，得到第四樣本；

(5)文庫擴增：將第四樣本加入擴增酶Mix和擴增引物進行PCR擴增，并進行磁珠純 化，得到目的DNA文庫；

(6)文庫檢測：將得到的文庫采用Qubit和11～13％的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測文 庫濃度、文庫片段大小及文庫質量，即得；

所述11～13％的PAGE配方為：水，3～4mL；30％丙烯酰胺，2022～2062μL；5*TBE， 1.2～1.8mL；9～11％AP，100～120μL；TEMED，9～11μL。

作為本發明進一步的方案：步驟(1)中的多重PCR引物為IonAmpliSeq^TMBRCA1and BRCA2Panel。

作為本發明進一步的方案：步驟(1)中的反應體系為10μL體系，反應體系的組成成 分具體為：

作為本發明進一步的方案：步驟(1)中PCR反應的循環數為18。

作為本發明進一步的方案：步驟(2)中的引物清除試劑為FuPaReagent^TM，加入量 為每個上述10μLPCR體系加入0.9～1.1μL引物清除試劑。

作為本發明進一步的方案：步驟(3)的接頭P1為：