[發(fā)明專利]一種快速診斷結(jié)核病潛伏感染的引物及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610140592.6
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105586429A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁俐;屈艷琳;曹帥麗;申愛平;劉微;趙繼利;曹旭東;陳創(chuàng)夫;吳長新
• 申請（專利權(quán)）人: 石河子大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 石河子恒智專利商標(biāo)代理事務(wù)所(普通合伙) 65102
• 代理人: 李伯勤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及采用分子生物學(xué)快速檢測的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種qRT-PCR技術(shù)快 速診斷結(jié)核病潛伏感染的引物及試劑盒。

背景技術(shù)

近年來結(jié)核病疫情呈加重蔓延之勢，其發(fā)病和死亡人數(shù)均居甲、乙兩類傳染病之 首，給個人、家庭、社會造成了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)和精神壓力。世界上約1/3的人感染 了結(jié)核分枝桿菌，其中約90％的人呈結(jié)核潛伏感染狀態(tài)(latentTBinfection,LTBI)。 大多數(shù)活動性結(jié)核都是因為潛伏感染者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌重新激活所致，所以及早診 斷、早治療潛伏感染者是降低結(jié)核病發(fā)病率，控制結(jié)核分枝桿菌傳播的重要途徑之一。

結(jié)核潛伏感染者因其沒有臨床癥狀和體征，診斷比較困難。目前用于診斷結(jié)核潛 伏感染的方法，是干擾素γ釋放實驗(interferongammareleaseassays,IGRAs)， 但IGRAs無法區(qū)分活動性結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者。結(jié)核潛伏感染者常被看成一種 感染但是并未發(fā)病的人群，但不同的結(jié)核潛伏感染者對結(jié)核分歧桿菌感染的免疫應(yīng)答 能力并不完全相同，活動性結(jié)核患者也有類似的特征。為了能夠快速、準(zhǔn)確篩查結(jié)核 潛伏感染者，本發(fā)明采用qRT-PCR技術(shù)設(shè)計獨特的、對結(jié)核分歧桿菌具有良好敏感性、 特異性的引物和試劑盒，對實現(xiàn)微量外周血快速診斷結(jié)核潛伏感染提供有效的輔助作 用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于結(jié)核病潛伏感染檢測的引物及試劑盒。

本發(fā)明的技術(shù)方案，qRT-PCR技術(shù)快速診斷結(jié)核病潛伏感染的引物，包括如下引 物中的至少一組引物：

第一組：<210>1，<210>2。

第二組：<210>3，<210>4。

第三組：<210>5，<210>6。

qRT-PCR技術(shù)快速診斷結(jié)核病潛伏感染的試劑盒，其組成成分包括：SYBR酶、cDNA 和下列引物引物中的至少一組：

第一組：<210>1，<210>2。

第二組：<210>3，<210>4。

第三組：<210>5，<210>6。

結(jié)核潛伏感染者的靜脈血經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后TNF-α、IFN-γ、 IL-2的mRNA表達水平2.5-4.1、8.1-13.2、184.2-220.6。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明引物和試劑盒根據(jù)結(jié)核分歧桿菌的特異基因序列而定， 尋找具有易于預(yù)測的、檢測的、發(fā)展價值的TNF-α、IFN-γ、IL-2因子，其在結(jié)核 病患者、結(jié)核潛伏感染者和健康人中的mRNA表達水平，特異性、敏感性高，而且用 血量少、用時短等特點，利用熒光定量PCR方法、使用本發(fā)明引物和試劑盒進行檢測 時，只需400μl外周靜脈血，有利于用于篩查老年人及兒童結(jié)核分枝桿菌潛伏感染， 整個過程耗時小于8小時。本發(fā)明對于結(jié)核病潛伏感染檢測及臨床用藥都有較高的參 考價值，可以廣泛推廣，為結(jié)核病防控工作提供技術(shù)支持。

具體實施方式

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對 本發(fā)明作進一步的詳細說明。

以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明 的保護范圍。

實施例1

檢測方法：

(1)采集受試者(潛伏感染者)外周靜脈血：肝素鈉抗凝處理，所有血樣，一 經(jīng)采集，立即送檢。取400μl分為兩份，每份200μl。一份加入合成的特異性抗原 (ESAT-6、CFP-10、TB7.7)，使其終濃度均達到20μg/ml，另一份不加任何抗原刺 激物作為對照組，是基礎(chǔ)分泌水平值，兩份血樣斡旋震蕩后，放入37℃溫箱孵育4 小時。

(2)血總RNA的提取：血樣孵育4小時后，用RNeasyMiniKit(Qiagen)試 劑盒按說明書逐步提取總RNA。為減少RNA降解，離心機溫度設(shè)定為4℃，所有操作 在冰袋上進行，并根據(jù)核酸蛋白檢測儀檢測D260/280紫外吸收率，確定RNA純度， 瓊脂糖凝膠電泳觀察其完整性。