[發明專利]全基因組范圍的植物基因功能鑒定的方法

有效

• 申請號: 201610140329.7
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105734130B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 張春義;路小鐸;范云六
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所;齊魯師范學院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.全基因組范圍的玉米基因功能鑒定的方法，其特征在于，包括如下步驟：

A、對玉米進行單核苷酸突變，構建玉米突變體庫；

B、檢測步驟A所述玉米突變體庫中突變體的表型，構建玉米突變體表型數據庫；

C、檢測步驟B所述玉米突變體庫中突變體的基因型，構建玉米突變體基因型數據庫；

D、結合步驟B所述玉米突變體表型數據庫和步驟C所述玉米突變體基因型數據庫，確定所述玉米中由所述單核苷酸突變導致的SNP位點所在基因的功能；

步驟A具體如下：

（1）收集玉米的花粉，進行化學誘變處理，得到誘變后植物花粉；

（2）將步驟（1）得到的誘變后植物花粉涂抹在所述玉米的花絲上，得到授粉后玉米；

（3）步驟（2）得到的授粉后玉米經生長、結實，收獲種子，得到M1代種子，種植M1代種子，得到M1代玉米突變體，即構建得到玉米突變體庫；

步驟B具體如下：

（4）將步驟（3）得到的M1代玉米突變體自交，得到M2代植株；

（5）檢測步驟（4）得到的M2代植株不同發育時期的表型，構建玉米突變體表型數據庫；

步驟C具體如下：

（6）分別提取步驟（3）得到的每株M1代玉米突變體的基因組DNA；

（7）將步驟（6）得到的每株M1代玉米突變體的基因組DNA片段化，構建二代測序文庫，用玉米外顯子探針富集外顯子區域，測序，獲得每株M1代植物突變體的外顯子DNA序列；

（8）分別將步驟（7）得到的每株M1代植物突變體的外顯子DNA序列與玉米的基因組DNA序列比對，找出每株M1代植物突變體中的SNP位點，確定所述SNP位點所在基因的位置，將每株M1代植物突變體及其SNP位點所在基因的位置構成玉米突變體基因型數據庫；

步驟D具體包括如下方案Ⅰ或Ⅱ：

方案Ⅰ包括如下步驟：

（10）在步驟B中的所述玉米突變體表型數據庫中找出具有同類表型的M2代玉米對應的M1代植物突變體；

（11）在步驟C中的所述玉米突變體基因型數據庫中找出每株步驟（10）所述具有同類表型的M1代植物突變體的SNP位點所在的基因，分析所述玉米突變體基因型數據庫和所述玉米突變體表型數據庫之間的連鎖關系，如果所述SNP位點所在基因相同，則所述SNP位點所在的基因是與所述表型相關的基因；

方案Ⅱ包括如下步驟：

（12）在步驟C中的所述玉米突變體基因型數據庫中找到目標基因中所有能導致基因編碼蛋白改變的SNP位點對應的M1代植物突變體；

（13）在步驟B中的所述玉米突變體表型數據庫中找到步驟（12）中每個M1代植物突變體對應的M2代植物的所有表型，如果表型相同，則所述目標基因為是與所述表型相關的基因；

具體地，步驟A中將花粉與甲基磺酸乙酯溶液按g:ml=1:50-150的比例混合40-50min，得到誘變后植物花粉；所述甲基磺酸乙酯溶液的濃度為0.08-0.12 v/v%；

步驟C中在測序前包括對基因組DNA進行超聲破碎，回收200-400 bp DNA片段的步驟；

步驟C中在超聲破碎后測序前還包括如下步驟：

a)將所述200-400 bp DNA片段進行DNA末端修復，得到末端修復DNA；其中，100μl DNA末端修復的反應體系為：30μl所述200-400 bp DNA片段、4μl 0.4mM dNTP Mix、1μl Klenow酶、5μl T4 DNA聚合酶、5μl T4 PNK、10μl 10×T4 DNA連接酶緩沖液，10μl 1mM ATP，用ddH₂O補足至100μl；DNA末端修復的反應溫度為20oC，反應時間為30分鐘；

b)將步驟a）得到的末端修復DNA 3’末端加A，得到3’末端加A的DNA；其中，50μl 3’末端加A的反應體系為：32μl末端修復DNA、3μl Klenow Exo-酶、5μl 10×Klenow酶緩沖液、10μl1mM ATP；3’末端加A的反應溫度為37oC，反應時間為30分鐘；

c）將步驟b）得到的3’末端加A的DNA連接接頭，回收300-500bp的片段，即為接頭DNA；

其中，接頭序列如下：

5'-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3’

5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；

d)將步驟c）得到的接頭DNA進行PCR擴增，回收300-500bp的目的片段，得到全基因組測序文庫；

e) 將步驟d）得到的全基因組測序文庫用玉米外顯子探針捕獲，得到外顯子組測序文庫；

其中，PCR擴增使用的模板為所述接頭DNA，使用的引物序列分別如SEQ ID NO:3-16所示。