[發明專利]一種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分離和培養方法

有效

• 申請號: 201610139799.1
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105586307B
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發明（設計）人: 李巍;樓琦;石巧娟;盧領群;郭紅剛;杜江濤;薩曉嬰;褚曉峰
• 申請（專利權）人: 浙江省醫學科學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 陳升華

本發明公開了一種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分離和培養方法，分離方法包括：1)將長爪沙鼠的肝臟，先移入聯合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝臟呈糊狀，再移入混合酶液，攪拌消化，得到攪拌消化后的產物；2)加入第一Hank’s液，過濾，得肝組織；然后加第二Hank’s液，初步離心，得沉淀；用第三Hank’s液重懸沉淀，再向其加入Nycodenz液混勻，再次離心，得渾濁帶，渾濁帶即為分離得到的肝星狀細胞。分離培養方法包括：分離以及培養。本發明方法能夠提高肝星狀細胞的產量和活率，可以保證HSCs純度，為進一步研究肝星狀細胞在肝損傷后細胞基質的沉積及纖維化的形成奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及肝星狀細胞的分離培養領域，具體涉及一種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分離和培養方法。

背景技術

肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)，又稱儲脂細胞(Fat-store cell，FSC)、間質細胞，主要分布于肝細胞與肝竇內皮細胞之間的竇周隙內(Disse間隙)。HSC在肝纖維化的發生發展中具有核心作用，是促進肝纖維化發展的主要因素。靜息狀態的HSC主要參與維生素A的代謝調節，當肝臟受到化學、物理及生物因素刺激而發生損傷后，HSC發生增殖并被活化，合成以膠原蛋白為主的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)及各類細胞因子如MMPs、TNF-α等，參與受損肝組織的修復。刺激持續發生時，HSC大量激活，引發ECM的合成與降解失衡，進而導致肝臟內結締組織異常沉積，發生肝纖維化。

肝星狀細胞是肝纖維化的主要效應細胞，在肝竇內，還有肝竇內皮細胞、kupffer細胞等。肝星狀細胞占整個肝臟細胞的8.00～13.00％左右，被認為是肝臟中主要的貯存和代謝維生素A的細胞。肝星狀細胞激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞，各種致纖維化因素均把HSC(肝星狀細胞)作為最終靶細胞，正常情況下肝星狀細胞處于靜止狀態。當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，肝星狀細胞被激活，其表型由靜止型轉變為激活型。激活的肝星狀細胞一方面通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建，另一方面通過細胞收縮使肝竇內壓升高。

國內一些作者采用原位灌流法分離HSC，因肝臟在體灌注，灌注液不易回收，酶的用量較大，且難以掌握酶灌流時的溫度，肝消化后摘取困難。目前針對大、小鼠分離培養HSC的方法已經較為成熟，但是國內尚無關于長爪沙鼠HSC的研究，而國外也尚未建立完善的培養體系，且長爪沙鼠HSC的研究不同于大、小鼠，彼此不能相互借鑒。

申請公布號為CN103805553A(申請號為201210455728.4)的中國發明專利申請公開了一種小鼠肝星狀細胞的分離方法，通過插管固定、灌注消化、細胞分散、小鼠肝星狀細胞分離等步驟完成對小鼠肝星狀細胞的分離。用上述方法得到了需要的小鼠肝星狀細胞，質量很好，比傳統大鼠的分離質量好很多，而且在整個過程比較便捷，在普通實驗室就能完成，很穩定，由于采用了小鼠，不用一些特殊的設備，降低了這種分離方法的成本，在得到高質量的小鼠肝星狀細胞，為進一步深入研究小鼠肝星狀細胞的生物學行為創造了條件。該技術方案采用原位灌流法分離HSC，因肝臟在體灌注，灌注液不易回收，酶的用量較大，且難以掌握酶灌流時的溫度，肝消化后摘取困難。同時該技術方案不適合用于長爪沙鼠HSC。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分離方法，能夠提高肝星狀細胞的產量和活率，可以保證HSCs純度。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分離方法，包括：

1)將長爪沙鼠的肝臟，先移入聯合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝臟呈糊狀，再移入混合酶液，攪拌消化，得到攪拌消化后的產物；