[發(fā)明專利]DNA條形碼制備方法及草莓疫霉紅心病菌DNA條形碼

有效

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• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105734049B
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發(fā)明（設計）人: 高瑞芳;章桂明;程穎慧;汪瑩;王穎
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產(chǎn)權代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩

本申請公開了一種DNA條形碼制備方法及草莓疫霉紅心病菌DNA條形碼。本申請的制備方法，包括用高通量測序技術對靶標菌株基因組DNA進行測序，并對測序結果進行生物信息學分析，采用系統(tǒng)進化樹分析基因組DNA中各基因片段進化關系，獲得靶標菌株與同屬菌株的相似度大于或等于95％、小于100％，片段不大于1000bp的單拷貝基因片段，對單拷貝基因片段進行遺傳距離分析，能真實反映親緣關系的即靶標菌株DNA條形碼。本申請的制備方法，利用高通量測序技術對基因組DNA進行全面分析，并用系統(tǒng)進化樹和遺傳距離分析，獲得DNA條形碼；為DNA條形碼制備提供了一種簡單、有效途徑；獲得的DNA條形碼能最有效表征靶標菌株。

技術領域

本申請涉及DNA檢測領域，特別是涉及一種DNA條形碼的制備方法及草莓疫霉紅心病菌的DNA條形碼。

背景技術

疫霉屬包含100余個種，是最主要的植物病原真菌。草莓疫霉紅心病菌Phytophthora fragariae var.fragariae(以下簡寫為P.fragariae)，是引起草莓屬植物紅心病的病原菌，其寄主包括草莓屬和部分懸鉤子屬植物，例如羅甘莓和黑莓等，引起的癥狀有植株矮小、葉片和葉柄萎縮、根莖紅心甚至整株植株死亡。游動孢子是它們侵染植物主要的傳播途徑。不能通過空氣傳播，但孢子可以在土壤和植物材料上存活很久，通過排水、灌溉進行擴散和傳播。一旦感染，可以在數(shù)年內蔓延至整個果園，嚴重影響了水果生長。在歐盟、美國和中國等都被列為檢疫性有害生物。

草莓疫霉紅心病菌是疫霉屬中的重要植物病原菌，對農作物危害巨大。目前對兩者的檢測方法主要還是傳統(tǒng)的形態(tài)學檢測。因此，亟需一種簡單、快速、有效地區(qū)分草莓疫霉紅心病菌的檢測或鑒定手段。

DNA條形碼是指生物體內能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異、易擴增且相對較短的DNA片段。目前，縱觀動物、植物、微生物等的DNA條形碼的制備思路和方法，絕大多數(shù)都是以常見的ITS片段、線粒體色素氧化酶基因Ⅰ、核糖體大亞基、核糖體小亞基、RNA酶亞基Ⅱ、翻譯延長因子、線粒體小亞基操縱子、β-維管束蛋白、肌動蛋白、幾丁質合成酶基因、鈣調蛋白、熱激蛋白90等DNA片段作為候選片段，其對物種區(qū)分鑒定都有一定的有限性，例如種內、種間差異不明顯，沒有明顯的條碼間隔，近似種區(qū)分不開，檢疫性物種與非檢疫性物種無法區(qū)分等。基因組DNA是一個龐大的數(shù)據(jù)庫，從理論上來說，其應該具有大量的可以代表物種，且符合要求的DNA條形碼；但是，目前暫沒有相關的研究和報道。對于草莓疫霉紅心病菌來說，目前也還沒有其DNA條形碼的相關研究和報道。因此，為了進一步統(tǒng)一和規(guī)范草莓疫霉紅心病菌的檢測和鑒定，亟需對草莓疫霉紅心病菌的DNA條形碼進行研究和開發(fā)。

發(fā)明內容

本申請的目的是提供一種DNA條形碼的制備方法，以及所制備的草莓疫霉紅心病菌的DNA條形碼。

本申請采用了以下技術方案：

本申請的一方面公開了一種DNA條形碼的制備方法，包括采用高通量測序技術對靶標菌株的基因組DNA進行測序，并對測序結果進行生物信息學分析，然后采用系統(tǒng)進化樹分析基因組DNA中各個基因片段的進化關系，獲得靶標菌株與同屬其它菌株的相似度大于或等于95％、而小于100％，并且片段不大于1000bp的單拷貝基因片段，對所述單拷貝基因片段進行遺傳距離分析，其中能夠真實反映親緣關系的單拷貝基因片段即所述靶標菌株的DNA條形碼。

需要說明的是，本申請的關鍵在于，有效的利用高通量測序技術，對基因組DNA進行全面的分析，并采用系統(tǒng)進化樹分析，最后利用遺傳距離分析獲得DNA條形碼。采用本申請的制備方法獲得的DNA條形碼，能夠有效的表征靶標菌株，為靶標菌株的DNA條形碼制備提供了一種最有效的解決方案。本申請中，能夠真實反映親緣關系的單拷貝基因片段是指，采用該單拷貝基因片段進行進化關系分析時，其與同屬其它種之間的遺傳距離更近，屬于同一分支，而與其它屬的菌株之間的遺傳距離更遠，屬于不同分支，則判定該單拷貝基因片段能夠真實反映親緣關系。

優(yōu)選的，生物信息學分析包括基因組拼接和基因注釋。