[發明專利]篩選三陰性乳腺癌特異性血清代謝標志物的方法

有效

• 申請號: 201610137478.8
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105738526B
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 輦偉奇;李麗仙;鄭曉東;易琳;張海偉;林昌海;劉興明
• 申請（專利權）人: 重慶市腫瘤研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 重慶信航知識產權代理有限公司 50218
• 代理人: 穆祥維

1.篩選三陰性乳腺癌特異性血清代謝標志物的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)選取多個三陰性乳腺癌女性患者血清作為實驗組A；選取與實驗組A數量相等的正常女性血清作為對照組B；

(2)室溫解凍實驗組A和對照組B的血清后，分別精準吸取100μL血清樣本在不同的1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，甲醇為HPLC級甲醇，其比例為樣品：甲醇＝1:4，渦旋30s，進行4℃，12000rpm離心15min，吸取200μL上清液，轉入進樣小瓶中待檢測；

(3)將不同血清樣本的小瓶分別放置在LC-Q/TOF-MS實驗儀器的分析平臺上進行色譜分離和質譜檢測；

色譜分離條件為：柱溫為40℃，流速0.35mL/min；流動相組成：①實驗組A為：水+0.1％甲酸，其中，水為蒸餾水；②對照組B為：乙腈+0.1％甲酸；進樣量為4μL，自動進樣器溫度4℃；

質譜條件：①采用正離子模式進行檢測條件：以氮氣作為霧化、錐孔氣；飛行管檢測模式V型，毛細管電壓4kV、錐孔電壓35kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度350℃、反向錐孔氣流50L/h、脫溶劑氣600L/h、萃取錐孔4V；②負離子模式條件：毛細管電壓3.5kV、錐孔電壓50kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度300℃、反向錐孔氣流50L/h、脫溶劑氣700L/h、萃取錐孔4V；離子掃描時間0.03s、掃描時間間隔0.02s、數據采集范圍：50-1000m/z；

(4)通過Mass Profiler軟件對LC-Q/TOF-MS實驗儀器獲得的LC/MS數據進行預處理，并在EXCEL 2010軟件中進行后期編輯，將最終結果組織為二維數據矩陣，包括變量、觀察量和峰強；然后將所有數據歸一化到總信號積分；

(5)將編輯后的數據矩陣導入SIMCA-P軟件進行主成分分析，獲得正模式下的主成分和負模式下的主成分累積R2X值和Q2值，R2X值為模型的解釋率，Q2值為模型的預測率；

(6)采用監督性的偏最小二乘方判別分析PLS-DA對兩組樣本進行分析，其模型質量參數為：正模式下的主成分和負模式下的主成分累積R2X值、R2Y值和Q2值；R2X值為模型的解釋率，R2Y值為模型的解釋率，Q2值為模型的預測率；

(7)進一步采用監督式方法OPLS-DA進行建模分析，獲得正模式下的主成分和負模式下的主成分累積R2X值、R2Y值和Q2值，R2X值為模型的解釋率，R2Y值為模型的解釋率，Q2值為模型的預測率；

(8)采用OPLS-DA模型的VIP值，并結合t-test的p值來尋找差異性表達代謝物，其中，VIP值即閾值，且閾值>1，p＜0.05；差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數據庫，比較質譜的質荷比m/z或者精確分子質量mass；篩選并鑒定與三陰性乳腺癌發生、轉移相關的生物標志物為：溶血性卵磷脂和小分子氨基酸，所述溶血性卵磷脂為LysoPC(0:0/18:0)、LysoPC(15:0)、LysoPC(16:0)、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(18:0)、LysoPC(18:1(11Z))、LysoPC(18:3(6Z,9Z,12Z))、LysoPC(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))、LysoPC(20:1(11Z))、LysoPC(20:2(11Z,14Z))、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))和LysoPC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))中的任意一種或多種，所述小分子氨基酸為Creatine、L-Proline、L-Threonine、L-Valine、L-Leucine、L-Tryptophan、L-Tyrosine和N-Acetyl-L-Histidine中的任意一種或多種。