[發(fā)明專利]一種基于pH響應(yīng)階段添加糖化酶發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610137420.3
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105586367A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石貴陽;陳堅(jiān);王寶石;胡志杰;蔣小東;孫福新;金賽;譚鳳玲;張梁;李由然
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);江蘇國信協(xié)聯(lián)能源有限公司
• 主分類號: C12P7/48
• 分類號: C12P7/48;C12P19/14;C12R1/685
• 代理公司: 江蘇英特東華律師事務(wù)所 32229
• 代理人: 邵鋆

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于pH響應(yīng)階段添加糖化酶發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法。

背景技術(shù)

檸檬酸（CitricAcid）是一種具有多種功能的重要有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域，是當(dāng)前世界上產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的食用有機(jī)酸，全球產(chǎn)量超過170萬噸。同時，檸檬酸又具有優(yōu)良的生物特性，在生物聚合、藥物運(yùn)輸、細(xì)胞培養(yǎng)等新興產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力，其需求量以每年5%的速度增長。

檸檬酸往往通過液態(tài)深層發(fā)酵法獲得，工業(yè)化生產(chǎn)中仍然沿用傳統(tǒng)的分批發(fā)酵方式。因黑曲霉具有酶系豐富、底物廣泛、產(chǎn)率高等優(yōu)勢，是檸檬酸發(fā)酵最重要的菌株，黑曲霉自身能夠分泌糖化酶，一般采用邊糖化邊發(fā)酵的方式。但在黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸過程中，隨著合成的檸檬酸不斷積累，發(fā)酵液pH會顯著下降，糖化酶活性逐步受到抑制，致使終發(fā)酵醪液中殘?zhí)瞧撸l(fā)酵周期較長。

現(xiàn)有技術(shù)針對檸檬酸發(fā)酵過程的糖化作用進(jìn)行了一些研究。申請?zhí)?01010513719.7的發(fā)明專利“一種添加糖化酶發(fā)酵制備檸檬酸的方法”公開一種在液化后接種前，降溫至40~60℃添加糖化酶的工藝，其缺點(diǎn)是加酶溫度太高，大部分糖化酶失活，導(dǎo)致糖化酶利用率低；申請?zhí)?01110162278.5的發(fā)明專利“一種發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法”公開了在接種發(fā)酵后，在36~38℃正常控溫過程中添加糖化酶；申請?zhí)?01210009294.5的發(fā)明專利“一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法”公開了在檸檬酸發(fā)酵菌種接種后的0~8小時內(nèi)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加糖化酶。

上述幾種方法基于共同的指導(dǎo)思想即通過添加糖化酶在發(fā)酵初期即獲得高濃度的小分子糖（如葡萄糖），但并未解決發(fā)酵過程中后期pH顯著下降、糖化酶活力損失而引起葡萄糖供應(yīng)與菌株耗糖速率不協(xié)調(diào)、檸檬酸合成速率放緩、發(fā)酵周期偏長、殘?zhí)橇科叩葐栴}。同時帶來新的問題：發(fā)酵初期培養(yǎng)基本身存在葡萄糖，自身分泌的糖化酶已能夠滿足發(fā)酵菌株對營養(yǎng)的需求，過高濃度葡萄糖反而會抑制菌種的生長，延長發(fā)酵延滯期，不利于檸檬酸的快速合成。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于pH響應(yīng)階段添加糖化酶發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法，該方法能解決檸檬酸發(fā)酵中后期糖化酶活力損失的問題，有效縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵轉(zhuǎn)化率，降低終發(fā)酵液殘?zhí)橇俊?

為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種基于pH響應(yīng)階段添加糖化酶發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法，包括將淀粉質(zhì)原料進(jìn)行調(diào)漿、液化、接種發(fā)酵，制得終發(fā)酵液，還包括在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，當(dāng)發(fā)酵液pH降至2.0~3.0時，向其中分階段等量添加糖化酶的步驟。

具體地，所述分階段等量添加為每間隔2~8h等量添加。

具體地，所述糖化酶的添加總量是基于所述發(fā)酵液中殘余非葡萄糖的含量（殘余總糖與殘余葡萄的差值）來確定，添加總量為40~1000U/g殘余非葡萄糖量。

具體地，所述淀粉質(zhì)原料包括玉米粉、小麥粉、木薯粉、紅薯粉、淀粉、糖蜜、小麥中的至少一種。

優(yōu)選地，本發(fā)明具體包括以下步驟：

（1）將所述淀粉質(zhì)原料粉末與水按照1:1.5~1:4比例混合均勻，調(diào)節(jié)pH至5.8~6.0，然后添加高溫α—淀粉酶，所述淀粉酶添加量為15~50U/g粉末；

（2）將步驟（2）獲得的混合料液經(jīng)過兩次噴射，一次噴射溫度95~105℃，二次噴射溫度120~130℃，經(jīng)碘試合格，獲得液化混液，再將所述液化混液經(jīng)過板框過濾獲得液化清液；

（3）將步驟（2）獲得的液化混液與水混合，加氮源，調(diào)節(jié)混合液總糖為6~12%，總氮為0.2%~0.4%，得到種子培養(yǎng)基；

（4）將黑曲霉孢子懸液接種步驟（3）中的種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，得到成熟種子液；

（5）將步驟（2）獲得的液化混液、液化清液與水混合，調(diào)節(jié)混合液的總糖為16~18%，總氮為0.05~0.15%，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；

（6）將步驟（4）獲得的成熟種子液接種至步驟（5）獲得的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20~32h；

（7）當(dāng)上述發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵液pH降至2.0~3.0時，每間隔2~8h向其中等量添加糖化酶，添加總量為40~1000U/g殘余非葡萄糖量。

如無特殊說明，以上所述百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)（wt%）。

本發(fā)明具有如下有益技術(shù)效果：