[發明專利]一種含有重組乙肝病毒基因的真核漢遜酵母工程菌的構建及乙肝表面抗原的生產方法

有效

• 申請號: 201610137245.8
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105734066B
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 黃恩啟;吳常偉;李超;王力衛;劉術敏;程英杰;陶立峰;楊世龍
• 申請（專利權）人: 安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司;重慶智飛生物制品股份有限公司;北京智飛綠竹生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/51
• 分類號: C12N15/51;C12N15/81;C12N1/19;C07K14/02
• 代理公司: 安徽知問律師事務所 34134
• 代理人: 代群群

1.一種真核漢遜酵母工程菌，其特征在于，分類命名為HBsAg1.0-38G1，并于2016年1月15日保藏于位于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC No：M2016039。

2.一種采用權利要求1所述的真核漢遜酵母工程菌HBsAg1.0-38G1表達和生產adr型乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)種子液制備：取1mL真核漢遜酵母工程菌HBsAg1.0-38G1工作種子，轉接于1.2LBMGY培養基中，在35℃下振蕩培養48小時，待OD600值達到2～6后，將其作為種子液，備用；

2)初培養階段：在30L發酵罐中盛放15L基礎發酵培養基，用14％氨水調整并維持至pH為5.5，按照每升基礎發酵培養基中加4.37mL微量鹽溶液PTM1的比例，添加65.55mL PTM1，在35℃下，自動控制溶氧不低于30％；

3)甘油流加培養階段：待甘油耗盡，溶氧上升時，流加甘油，通過蠕動泵流加50％甘油，其中含有12mL/L的PTM1，甘油補加速度為7g/min，至菌體濕重為250g/L后，調節轉速和通氣量使溶氧不低于20％，此階段，用14％氨水將pH值調節至6.0；

4)甲醇誘導階段：停止甘油流加后，讓菌體饑餓30min，通過蠕動泵流加補料液，補料液為100％甲醇，其中含有12mL/L的PTM1，甲醇體積濃度維持在6.0～6.4％，pH用14％氨水調整并維持至6.0，調節轉速和通氣量，控制溶氧量不低于20％至菌體濕重300g/L，再將轉速調到大于1300rpm，空氣通量最大，至發酵總時100h下罐；

5)發酵液經5000rpm4℃離心10分鐘，留取沉淀；

所述步驟2)中基礎發酵培養基由4.29％磷酸二氫鉀，0.5％硫酸銨，1.43％硫酸鉀，1.17％七水硫酸鎂，0.10％二水硫酸鈣，0.5882％二水檸檬酸鈉，3.00％甘油組成；

所述步驟2)、步驟3)和步驟4)中PTM1由0.6％硫酸銅，0.008％碘化鈉，0.3％硫酸錳，0.02％鉬酸鈉，0.002％硼酸，0.05％氯化鈷，2％氯化鋅，6.5％硫酸亞鐵，0.025％生物素，0.5％硫酸組成。