[發(fā)明專利]抗羊IgMμ鏈單克隆抗體、分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610136665.4
• 申請(qǐng)日: 2016-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN107177556B
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蒙學(xué)蓮;朱學(xué)亮;竇永喜;才學(xué)鵬;張志東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N5/20
• 分類號(hào): C12N5/20;C07K16/42;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發(fā)明公開了抗羊IgMμ鏈單克隆抗體、分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其用途。本發(fā)明以分泌型IgM蛋白為靶蛋白，克隆獲得IgMμ鏈基因的完整開放閱讀框，亞克隆至原核表達(dá)載體，利用鎳柱純化重組蛋白，并對(duì)6?8周齡的雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，當(dāng)抗體滴度在1∶10000以上時(shí)，對(duì)免疫小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選獲得分泌抗羊IgMμ鏈的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；向6?8周齡的經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，注射7天左右收集腹水，protein G/A瓊脂糖珠純化腹水，獲得純度較高的抗羊IgMμ鏈的單克隆抗體。本發(fā)明提供的單克隆抗體效價(jià)高，可用于羊IgM免疫球蛋白的檢測(cè)，并且有望實(shí)現(xiàn)對(duì)多種羊病的早期篩查與監(jiān)測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用范圍和社會(huì)需求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗羊IgMμ鏈單克隆抗體，還涉及分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

IgM是免疫球蛋白之一，分泌型IgM為五聚體，是分子量最大的Ig(約900KD)，主要存在于血液中，占血清免疫球蛋白總量的5％～10％。IgM是抗原初次刺激機(jī)體后體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，是機(jī)體抗感染的“先鋒部隊(duì)”；具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性和細(xì)胞溶解活性，是抗血管內(nèi)感染的第一線抗體，IgM抗體一般為保護(hù)性抗體，對(duì)防止菌血癥起主要作用。

在生物進(jìn)化中，IgM也是出現(xiàn)最早的Ig。在胚胎發(fā)育晚期，胎兒就開始具有產(chǎn)生IgM的能力，但是IgM不能通過(guò)胎盤。一旦發(fā)生感染，機(jī)體就快速產(chǎn)生IgM，但持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，IgM的半衰期短，僅5.1天，而且在感染的早期即已產(chǎn)生。此外，由于IgM在結(jié)合補(bǔ)體和活化補(bǔ)體后可通過(guò)補(bǔ)體活化片段發(fā)揮調(diào)理吞噬的作用的能力均較IgG強(qiáng)。因此，血清中檢出特異性IgM抗體水平標(biāo)志著機(jī)體近期發(fā)生了感染，對(duì)某些傳染病的早期診斷具有較高的臨床價(jià)值。

隨著科技的發(fā)展，流通方式日趨走向多元化和頻繁化，造成多種傳染病跨地區(qū)、跨國(guó)界傳播，對(duì)衛(wèi)生安全帶來(lái)了更大的危害。因此，對(duì)某些傳染病，尤其是潛伏期較長(zhǎng)的傳染病而言，早期診斷具有重要的防治價(jià)值。

重鏈μ鏈?zhǔn)荌gM分子所特有，抗IgMμ鏈單克隆抗體具有高效、特異性結(jié)合IgM的特性，在體外診斷試劑領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用。市場(chǎng)上不易購(gòu)買到不同物種的IgMμ鏈。在制備其單克隆抗體時(shí)，一般采用SDS-PAGE切膠獲取免疫用μ鏈，方法繁瑣，回收率不高。本實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)制備羊IgMμ鏈，以鎳瓊脂糖親和層析和陽(yáng)離子交換層析純化的重組蛋白免疫動(dòng)物，獲得分泌抗羊IgMμ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一株能夠穩(wěn)定分泌抗羊型IgMμ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

本發(fā)明的目的之二是提供由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的抗羊IgMμ鏈的單克隆抗體。

本發(fā)明的目的之三是提供所述雜交瘤細(xì)胞株以及單克隆抗體在制備診斷或檢測(cè)羊IgM免疫球蛋白及其抗體試劑中的應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明以分泌型IgM蛋白為靶蛋白，克隆獲得IgMμ鏈基因的完整開放閱讀框，并將其亞克隆至原核表達(dá)載體，利用鎳柱純化重組蛋白，并對(duì)6-8周齡的雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，當(dāng)抗體滴度在1∶10000以上時(shí)，對(duì)免疫小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選獲得分泌抗羊IgMμ鏈的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；向6-8周齡的經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，注射7天左右收集腹水，protein G/A瓊脂糖珠純化腹水，獲得純度較高的抗羊IgMμ鏈的單克隆抗體。

本發(fā)明的一株能夠穩(wěn)定分泌抗羊型IgMμ鏈單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為5D1，分類命名為小鼠骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為:CGMCC No.11283，保藏時(shí)間為2015年10月12日。