[發明專利]筑波鏈霉菌及其在制備他克莫司中的應用

有效

• 申請號: 201610135737.3
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105624068B
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發明（設計）人: 吳萍;楊永梅;顏仁江;方一民;張薇
• 申請（專利權）人: 杭州中美華東制藥有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/18;C12R1/465
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種筑波鏈霉菌(streptomyces tsukubaensis)HDW68及其應用，該菌種由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2016086，保藏日期為：2016年03月07日。本發明還公開了一種由此菌株發酵制備他克莫司中間體的方法。本發明提供的發酵工藝經1噸、4噸、20噸發酵罐的生產實踐，證明其生產能力穩定，發酵單位高且發酵副產物(FK520)相對較少，大大地降低了后提取的難度，適宜工業化大生產且獲得的他克莫司產品質量高。

技術領域

本發明涉及一種新型微生物及其用途和應用，尤其涉及一種筑波鏈霉菌及其在制備他克莫司中的應用。

背景技術

他克莫司(Tacrolimus)又名FK506，其化學結構屬23元大環內酯類抗生素，為一種強力的新型免疫抑制劑。在分子水平，本品的作用是由細胞質內與之結合的蛋白FKBP12介導的。FKBP12使得本品進入細胞內，并形成復合物，該復合物競爭性地與鈣調素特異性地結合并抑制鈣調素，后者介導T細胞內-鈣依賴性抑制性信號傳遞系統，從而阻止一系列淋巴因子基因轉錄。體內外實驗證明，他克莫司是一強效的免疫抑制劑，可抑制細胞毒淋巴細胞的形成，移植排斥反應主要是由后者引起。該藥抑制T細胞活化及TH細胞依賴性的B細胞增殖，以及淋巴因子的生成如白細胞介素2，白細胞介素3及β-干擾素，以及白細胞介素-2受體的表達。他克莫司可抑制皮膚、心臟、腎、肝移植的排斥反應，延長同種移植物的存活時間，已在嚙齒類動物、犬、靈長類動物和人類身上得到證實。上市以來已廣泛用于肝、腎和骨髓移植的急慢性排斥治療。

目前有關他克莫司生產方法的報道主要有美國專利US4894366，US4929611，US5116756，US5264355，US5496727和US5624842。這些專利報道了用不同的鏈霉菌株生產他克莫司，產量不是很高，US5116756專利中提到的streptomycessp.MA6858和US5624842中提到的streptomyces tsukubaensis的他克莫司生產菌株，生產他克莫司的產量都很低，其發酵液中他克莫司的濃度最高只有37.8mg/L。中國專利《發酵生產他克莫司的方法》(CN201310644714.1)報道一種鏈霉菌產他克莫司為385μg/ml，且需中間補料，工藝繁瑣。中國專利《一種鏈霉菌及其應用》(CN200810019003.4)公開的最高發酵單位為550μg/ml。中國專利《一種高純度他克莫司的制備方法》(CN 201210447477.5)公開的最高發酵單位為491μg/ml，但未提及發酵工藝。中國專利《基因工程菌筑波鏈霉菌L20及其應用》(CN201510664086.2)提到基因工程菌通過搖瓶發酵單位可達到716mg/L。

國外期刊《Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology》 (2009,36(12):1467-1471)一文《Strain development of Streptomyces sp.for tacrolimusproduction using sequential adaptation》中提到通過逐漸提高培養基中他克莫司的濃度600-1600μg/ml來增加菌株對產物的耐受性，最終獲得的菌株在5L發酵罐中達到972μg/ml。國內期刊《微生物學雜志》2014年10月第34卷第5期中的《抗性突變他克莫司高產菌株的選育》提到通過抗性突變育種得到高產菌株H-493，在50L發酵罐中能達到918μg/ml，但未經過工業化試生產。這兩種菌株都涉及抗性突變選育，其菌種后期的穩定性有待考察。

綜上所述，國內外報道的他克莫司發酵生產技術中，采用抗性突變菌株、基因工程菌的發酵技術單位高，但該發酵技術只經過小試試驗未經過工業化生產確認；采用常規菌株的發酵工藝單位低，并且發酵副產物較多，特別是其中的同分異構體FK520的含量較高，因為是同分異構很難通過后期的純化工藝去除，導致后提取工藝較為復雜，大大地增加了后續的提純難度，難以獲得高純度的最終產品，從而難以更好地進行產業化生產。

發明內容