[發明專利]一種采用顯微CT觀察昆蟲氣管立體結構的方法

在審

• 申請號: 201610135287.8
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN107179278A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: 畢擁國;王志剛
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: G01N21/00
• 分類號: G01N21/00;G01N1/28
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司13112
• 代理人: 白海靜

技術領域

本發明涉及一種昆蟲呼吸器官的觀察方法，具體涉及一種采用顯微CT觀察昆蟲氣管立體結構的方法。

背景技術

昆蟲的呼吸系統是昆蟲重要的氣體交換器官，對昆蟲呼吸器官結構的研究無論是從生物進化角度還是從昆蟲防治角度來講都是至關重要的。目前，常用來研究昆蟲呼吸器官的方法有兩種，石蠟切片法和透射電鏡法。

石蠟切片法又稱細胞切片法，是觀察組織細胞最常用的方法，采用石蠟切片法能清晰地辨認細胞的形態結構，尤其是該方法能有針對性的染色，可以只對需要觀察的神經細胞進行染色而將目標組織與其他物質區分開來。透射電鏡法是采用透射電子顯微鏡對昆蟲器官進行觀察，它能直接觀察昆蟲器官的內部超微結構，可放大100~10000倍。

但是，上述兩種方法的制片過程較為繁瑣，且只能觀測單張平面圖像，對需要觀察的已知位置的結構尚可，但對于未知結構來說，單張切片內容過于片面，無法全面的觀測和分析。由于昆蟲的呼吸器官結構十分復雜，包括氣門、氣管、微氣管，使用上述任何方法均無法從結構上予以立體、全面的觀察。

顯微CT（Micro-CT)是一種較新的技術，其可在不破壞樣本的前提下清楚了解樣本的內部顯微結構，精度可達到微米級別。其特點是能拍攝出立體照片，能觀察整個昆蟲內部各個截面的信息，并且可以對需要觀察的目標結構進行2D和3D分析。

顯微CT在生物醫藥方面最早主要應用于對骨骼、牙齒結構的研究，從2005年開始，Greco等人才將顯微CT技術應用于蜂類卵巢的研究。而至今為止，尚未發現采用顯微CT技術研究昆蟲氣管立體結構的報道。

發明內容

本發明的目的就是提供一種采用顯微CT觀察昆蟲氣管立體結構的方法，以解決現有觀察方法操作繁瑣、觀察結果不夠全面的問題。

本發明的目的是這樣實現的，一種采用顯微CT觀察昆蟲氣管立體結構的方法，包括以下步驟：a、樣本處理，在溫度為4℃的條件下使用固定液將目標昆蟲的呼吸器官進行組織固定；b、顯微CT觀察，利用顯微CT對處理好的樣本進行觀察。

所述步驟a是先用5%戊二醛溶液對目標昆蟲的呼吸器官浸泡固定或灌注固定48h，隨后使用0.2M的磷酸緩沖液清洗2h，清洗后再用1%四氧化鋨溶液浸泡固定1h，然后用蒸餾水清洗2h，最后使用濾紙將樣本表面液體吸干，并使用石蠟包埋。在整個處理過程溫度保持在4℃，且不能使用抽氣機進行抽真空，防止氣管內的氣體被抽出，而使液體進入氣管中，影響后續觀察結果。

所述5%戊二醛溶液是使用0.2M的磷酸緩沖液將其pH值調至7.2~7.4后再對樣本進行處理；所述1%四氧化鋨溶液是使用0.2M的磷酸緩沖液將其pH值調至7.2~7.4后再對樣本進行處理。

所述目標昆蟲的呼吸器官是光肩星天牛的下顎須或下唇須。

在進行樣本處理之前，先將光肩星天牛放置在4℃環境中預冷4 小時，隨后再將光肩星天牛的下顎須和/或下唇須從口器上取下。將光肩星天牛的下顎須和/或下唇須從口器上取下后應迅速將其放入固定液中進行組織固定，以避免其自然干燥。

所述步驟b是將處理好的樣本直接粘到樣品臺上觀察掃描，拍出的圖片經NRecon軟件重構，并以CTvox組成3D模式，并以CTan對圖像進行測量和分析。

本發明方法應用顯微CT對昆蟲的呼吸器官進行形態學觀察，建立呼吸器官的3D模型，可以同時獲得樣本的外部形貌和內部細節特征，圖像分辨率高，建模重構所獲3D模型空間視覺較好。而且本發明方法的樣本制作過程簡單，操作方便，儀器所占用空間較小，具有十分良好的推廣前景。

與傳統的組織切片技術相比，本發明具有明顯的優勢，主要表現為以下幾方面：無組織損傷性，快速高效，同時可以觀測呼吸器官的三維特征，可以重建并觀察任意平面，可重復性強。

通過本發明方法能對昆蟲的基本結構有一個從外到內、從平面到立體的綜合認識，本發明方法為全面觀察昆蟲內部的呼吸系統結構提供了重要依據和技術手段。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步闡述本發明，在以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法，所用試劑為市售分析純或化學純。

實施例1

觀察光肩星天牛下顎須內部氣管的立體結構。

固定液的配制：使用0.2M的磷酸緩沖液將5%戊二醛溶液的pH值調至7.2~7.4；使用0.2M的磷酸緩沖液將1%四氧化鋨溶液的pH值調至7.2~7.4。