[發(fā)明專利]超聲波輔助酶法提取腸激酶工藝

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610134992.6
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN107177575A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發(fā)明（設計）人: 費蘋;陳銀芳;費正明;陳明全
• 申請（專利權(quán)）人: 如皋市永興腸衣有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/57;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域的一種超聲波輔助酶法提取腸激酶工藝。

背景技術

外源蛋白的表達方式可分為直接表達和融合表達兩種，其中利用融合表達方式往 往能實現(xiàn)外源目的蛋白的高效表達，且利于分離純化。但有時目的蛋白不能以融合蛋白的 形式被使用，因此需要在目的蛋白和標簽蛋白之間設計特異的蛋白酶酶切位點，利用獨特 的蛋白酶切割，才能得到完整的目的蛋白。目前常見的工具蛋白酶有腸激酶，Xa 因子或凝血 酶等，其中腸激酶由于其能完全去除目的蛋白的 N 端序列，而最常被使用。（Gasparian, M. et al. Expression, purification, and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2003, 31(1), 133-9）。

腸激酶（Enteropeptidase，EP 或 ENterokinase，EK，EC3.4.21.9）是存在于脊椎 動物十二指腸內(nèi)的一種異源二聚體（heterodimeric）絲氨酸蛋白酶。分子量為 150KDa，由 1 條 115kDa 的重鏈和 1 條 35kDa 的輕鏈組成，在 pH 值 4.5-9.5，溫度 4-45℃范圍內(nèi)特異 性水解蛋白底物（LaVallie, E. R.. et al. Cloning and functional expression of a cDNA encoding the catalytic subunit of bovine enterokinase. J Biol Chem. 1993, 268(31), 23311-7）。由于 EP 裂解融合蛋白所釋放出的多肽具有和野生型完全一致的 N- 末端氨基酸序列，因而可以作為蛋白表達體系中融合蛋白的切割試劑（ Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Appl Microbiol Biotechnol. 2004, 65(4), 363-72）。但是天然的腸激酶來源有限，并且提取分離的成本 高，加之天然提取的腸激酶易被其它蛋白酶污染，易造成切割融合蛋白同時又降解了目的 產(chǎn)物。而基因工程技術正可以彌補這些不足，因而運用基因工程的方法生產(chǎn)腸激酶已成趨 勢。

目前已經(jīng)采用了原核或真核表達系統(tǒng)成功得到了有生物活性的重組豬、牛、小鼠 等腸激酶輕鏈蛋白，但很少關于鳉魚腸激酶輕鏈基因工程方面的研究。（Kitamoto, Y. et al. cDNA sequence and chromosomal localization of human enterokinase, the proteolytic activator of trypsinogen. Biochemistry. 1995, 34(14), 4562-8 ； Matsushima, M. et al. Structural characterization of porcine enteropeptidase. J Biol Chem. 1994, 269(31), 19976-82 ；Yahagi, N. et al. Complementary DNA cloning and sequencing of rat enteropeptidase and tissue distribution of its mRNA. Biochem Biophys Res ComM/Lun. 1996, 219(3), 806-12）

國外已有大量關于牛腸激酶研究的報道，但有關鳉魚腸激酶研究很少。有研究表明， 鳉魚腸激酶的特異性要遠高于目前常見的牛腸激酶、豬腸激酶和人腸激酶（Ogiwara, K. Specificity of the medaka enteropeptidase serine protease and its usefulness as

a biotechnological tool for fusion-protein cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007, 104(17), 7021-6）。其對非特異多肽底物的酶切活性不到牛腸激酶的 1/100，因此， 如果能利用基因工程方法得到重組鳉魚腸激酶，其應用價值將比重組牛腸激酶更高。目前， 重組鳉魚腸激酶輕鏈尚無商業(yè)化產(chǎn)品。