[發明專利]超臨界流體色譜分離純化腸激酶工藝

在審

• 申請號: 201610134989.4
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN107177573A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: 費蘋;陳銀芳;費正明;陳明全
• 申請（專利權）人: 如皋市永興腸衣有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程領域的一種超臨界流體色譜分離純化腸激酶工藝。

背景技術

腸激酶（Enterokinase，簡寫為 EK）是存在于哺乳動物十二指腸內的一種異源二 聚體絲氨酸蛋白酶。其天然蛋白分子量為150kDa，由一條115kDa 的重鏈和一條35kDa 的輕 鏈組成，在 pH 值 4.5-9.5 和溫度 4-45^OC 之間均可以特異性的水解蛋白底物。腸激酶識別 底物蛋白的序列為DDDDK，它可以在賴氨酸殘基的C 端進行切割。這樣的酶切優勢使其成為 了融合蛋白表達體系中理想的工具酶。天然提取的腸激酶很容易混有其它種類蛋白酶，限 制了其在基因工程中的廣泛應用。因此利用基因工程重組制備腸激酶逐漸成為大家選擇的 方向。

腸激酶由一條重鏈和一條輕鏈組成，重鏈又稱結構亞基，輕鏈又稱催化亞基，二者 通過分子間二硫鍵結合。結構亞基負責將腸激酶定位到小腸的刷狀緣膜上，催化亞基行使 催化活性，將胰蛋白酶原激活成為胰蛋白酶。為了高效獲得制備腸激酶催化亞基蛋白，有必 要開發基因工程重組腸激酶催化亞基。

發明內容

本發明為了解決然提取的腸激酶很容易混有其它種類蛋白酶，限制了其在基因工 程中的廣泛應用，提供了一種超臨界流體色譜分離純化腸激酶工藝。

本發明是通過以下技術方案實現的 ：

一種超臨界流體色譜分離純化腸激酶工藝，其特征在于：其步驟為 ：

⑴在牛腸激酶催化亞基的基因 EKL 上構建突變體 EKLM，突變體 EKLM 的核苷酸序列；

⑵替換掉突變體 EKLM 中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子從而獲得優化的基因序列，EKLMO，EKLMO 的核苷酸序列。

⑶在 EKLMO 的 5` 末端加入牛腸激酶自身的酶切位點序列，在 EKLMO 的 3` 末端加入標 簽序列，得到完整的表達基因片段。

⑷將上述表達基因片段克隆進入載體，構建得到高效表達載體，將其轉入大腸桿菌 BL21，用 IPTG 誘導重組基因的表達 。

⑸收集菌體，提純目的蛋白；所述 步驟⑶中標簽序列為四個連續的組氨酸標簽序列 HIS_4；；所述步驟⑸中提純目的蛋白采用的是包涵體變復性方法；所述包涵體變復性方法的步驟為：

①按照每 10g 菌體加入 30ml 比例加入到溶液 A 中重懸，破碎細胞，高速離心獲得包涵體；所述溶液 A 為 50mM Tris，pH 7.0 。

②利用溶液 B 清洗包涵體兩次 ；溶液 B 為 50mM Tris，pH 7.0，500mM NaCl，20mM EDTA， 2% Triton X-100 。

③向包涵體中加入20 倍包涵體質量的溶液C，溶解24h ；溶液C 為7.5M 鹽酸胍，pH 9.0， 50mM Tris，100mM 巰基乙醇 。

④溶解 24h 后將溶液 pH 調整至 3.5，采用溶液 D 進行透析 ；透析完成后，高速離心去 掉沉淀，上清逐漸滴加到 10 倍上清體積的復性溶液 E 中；所述溶液 D 為 7.5M 鹽酸胍，50mM Tris，pH 4.0 ；所述復性溶液 E 為 0.7M 精氨酸，pH 8.6，2mM 還原性谷胱甘肽，1mM EDTA 。

⑤復性 72h 后，采用溶液 F 對添加有上清的復性溶液 E 進行透析，透析完成后，高速離 心去掉沉淀，獲得目的蛋白溶液；溶液 F 為 20mM Tris，PH7.6，20mM NaCl，1mM CaCl_2；通過 包涵體變復性提純獲得目的蛋白溶液后采用鎳離子親和柱快速純化目的蛋白。

本發明具有生產工藝簡單，產品質量穩 定，且提純后的蛋白可以用于生物工程或藥物生產等多個目的，具有顯著的應用價值。

具體實施方式

制備重組牛腸激酶催化亞基蛋白的方法，其步驟為 ： ⑴為了提高重組蛋白的活性和穩定性，基于牛腸激酶的晶體結構，以牛腸激酶催化亞基的基因 EKL 為模板，設計突變體蛋白 EKLM，突變位點包括 C112S，S121P 和 Y175R。突變后 的 EKLM 的全長核苷酸序列。

⑵為了提高蛋白產量，替換掉突變體 EKLM 中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子 從而獲得優化的基因序列 EKLMO，EKLMO 的核苷酸序列。

⑶為了后續提純方便，在 EKLMO 的 5` 末端加入牛腸激酶自身的酶切位點序列。