[發明專利]一株穩定表達EML4-ALK基因的肺癌細胞株及其構建方法

有效

• 申請號: 201610134879.8
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105695414B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 趙瓊
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62;C12N15/12;C12N15/54
• 代理公司: 杭州知通專利代理事務所(普通合伙) 33221
• 代理人: 馮燕青

1.一株穩定表達EML4-ALK基因的肺癌細胞株，其特征在于，所述肺癌細胞株保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NO:C2015193。

2.一種穩定表達EML4-ALK基因的肺癌細胞株的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括以下步驟：

步驟a，過表達載體的構建：利用化學合成方法合成EML4-ALK序列片段，然后將目的基因EML4-ALK克隆到LV5載體中并測序鑒定；

步驟b，病毒包裝：將步驟a中構建好的重組質粒LV5-EML4-ALK-GFP/Puro轉入293T細胞，收集病毒上清液并進行滴度測定；

步驟c，細胞培養：A549細胞使用含10％FBS的DMEM培養基進行培養；

步驟d，病毒侵染：胰酶消化處于生長對數期的A549細胞，離心后用無抗生素的培養基重懸細胞，取A549細胞接種于培養皿中，待細胞貼壁后，向培養皿中加入步驟b中的病毒上清液進行培養；

步驟e，加藥篩選：棄去病毒上清液，換上含有10％FBS的正常培養基進行培養，接著用添加嘌呤霉素的完全培養基換液，每1-2天換液并拍照觀察熒光表達；持續培養7-14天后，侵染過的A549細胞正常生長，帶上綠色熒光，得到穩定表達EML4-ALK基因的肺癌細胞株；所述正常培養基的組分為DMEM+10％FBS；所述完全培養基的組分為DMEM+10％FBS+puromycin終濃度1μg/ml；

步驟a中，將目的基因EML4-ALK基因分成兩個片段進行合成，其中兩個片段分別為A:SEQ ID NO:1和B:SEQ ID NO:2；然后，利用EcoRV將兩個片段分別克隆到pUC57中，單酶切克隆反應后挑選出EML 4-ALK基因的兩個片段A、B的陽性克隆進行測序驗證；

步驟a中，將目的基因克隆到載體LV5的具體步驟如下：用NotI和BspHI對EML4-ALK基因片段A進行酶切，37℃酶切2小時；用BspHI和NsiI對EML4-ALK基因片段B進行酶切，37℃酶切2小時；用NotI和NsiI對慢病毒載體LV5進行酶切，37℃酶切2小時；酶切后電泳，用DNA凝膠回收試劑盒回收EML4-ALK基因片段A、EML4-ALK基因片段B和載體LV5，22℃連接2小時。

3.根據權利要求2所述的穩定表達EML4-ALK基因的肺癌細胞株的構建方法，其特征在于，步驟b中，病毒包裝質粒和重組質粒LV5-EML4-ALK-GFP/Puro轉入293T細胞，24小時后取出培養皿，棄去培養基，1×PBS清洗細胞3次，并輕柔地加入8ml新鮮的293T培養基，繼續培養；細胞轉染48小時后，收集培養基上清進行濃縮，更換新鮮培養基培養24小時后再次收集濃縮液，每次收集的病毒上清液用0.45μm的膜過濾。

4.根據權利要求2所述的穩定表達EML4-ALK基因的肺癌細胞株的構建方法，其特征在于，步驟d中，取5×10⁵個A549細胞接種于培養皿中，待細胞貼壁后，向培養皿中加入1.5ml配置好的病毒上清液，培養24小時。

5.根據權利要求2所述的穩定表達EML4-ALK基因的肺癌細胞株的構建方法，其特征在于，步驟e中，將融合度達到80％-90％的A549細胞消化，按照每孔5×10⁴細胞的密度將其接種在24孔板中培養24小時后，加入提前配制好的病毒上清液，并加入終濃度為5μg/mL的聚凝胺，病毒液孵育24小時后將病毒液棄去，換上含有10％FBS的正常培養基，24小時后將每個孔中的細胞傳至10cm的培養皿中，正常培養24小時后用添加嘌呤霉素的完全培養基換液；3-4天后，侵染病毒的細胞有部分死亡；繼續用含有嘌呤霉素的培養基培養細胞，每1-2天換液并拍照觀察熒光表達，持續培養7-14天后，侵染病毒的細胞正常生長、帶上綠色熒光。