[發明專利]抑制性tRNA通讀提前終止密碼子疾病中的截短蛋白

有效

• 申請號: 201610134656.1
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN107177592B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 夏青;王天暢;楊琦
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61P35/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;黃登高

本發明涉及利用構建抑制性tRNA延長致病基因無義突變體的截短蛋白，使哺乳動物細胞中產生全長有功能的蛋白，從而恢復突變體的正常結構和功能。發明中涉及無義突變的體系包括單基因遺傳病的致病基因和腫瘤細胞內的腫瘤抑制基因。本發明主要涉及構筑對應三種終止密碼子的19種抑制性tRNA，在哺乳動物細胞中高效通讀dystrophin蛋白，并在腫瘤細胞通讀無義突變蛋白，作用顯著。

技術領域

本發明屬于生物制藥領域，具體涉及利用構建抑制性tRNA延長致病基因無義突變體的截短蛋白，使哺乳動物細胞中產生全長有功能的蛋白，從而恢復突變體的正常結構和功能。本發明主要涉及構筑對應三種終止密碼子的19種抑制性tRNA，在哺乳動物細胞中通讀dystrophin蛋白并在腫瘤細胞通讀無義突變蛋白，作用顯著。

背景技術

無義突變及其引起的遺傳性疾病

人類基因組中的存在許多種基因突變類型，無義突變是基因突變中的一類。基因突變是基因組DNA分子發生的可遺傳的變異現象，其中包括移碼突變和堿基置換。移碼突變包括堿基的插入和缺失，堿基置換主要為錯義突變和無義突變。無義突變是指編碼基因的某個堿基發生突變，產生終止密碼子UAG、UAA和UGA，終止密碼子不編碼任何氨基酸。終止密碼子不能與轉移RNA(tRNA)的反密碼子配對，但能被終止因子或釋放因子識別，終止肽鍵的合成，使蛋白質合成終止，因而生成不完整和沒有功能的蛋白質。無義突變的發生使基因框內產生提前終止密碼子(Premature termination codons，PTC)，導致基因編碼的兩種結果，一種即產生截短型蛋白，另一種則導致含有PTC的mRNA的穩定性降低，從而引發相應的遺傳性疾病。據統計，大約有11.2％的單基因遺傳性疾病會產生PTC突變，被稱作提前終止密碼子病(Premature termination codons diseases，PTC diseases)，另一方面，許多癌癥發生也會產生PTC突變(KEELING K.M.et al.Critical reviews in biochemistry andmolecular biology，2012，47：444-463.)。

杜氏肌營養不良(Duchennemuscular dystrophy，DMD)是PTC疾病中的一個典型代表。DMD是一種嚴重的肌肉萎縮疾病，也是最常見的X連鎖隱性遺傳性疾病，以進展性、致死性為主要特點。DMD基因的無義突變則是導致DMD發生的主要原因之一。無義突變產生提前終止密碼子UAG、UAA、UGA，生成截短了的多肽產物，使患者缺失或缺少功能性的抗萎縮蛋白(dystrophin)，致使肌肉萎縮。據報道，Duchenne型肌營養不良癥在活產男嬰中的發病率為1/6300～1/3500[Dooley J.et al.Clin Pediatr(Phila)，2010，49：177-179.]。該病目前尚無有效治愈方法，多于幼年期發病，青少年期喪失行走能力，成年早期死亡，給患者個人、家庭和社會造成沉重心理和經濟負擔

抑制性tRNA通讀無義突變

人類基因組中的61種密碼子可以被tRNA識別，編碼20種氨基酸，三種終止密碼子(UAG、UAA、UGA)沒有相應的tRNA識別，不編碼氨基酸，進而終止翻譯。但是有研究發現，存在可以識別終止密碼子的tRNA，使終止密碼子編碼氨基酸，蛋白翻譯正常進行。這種能夠識別終止密碼子的tRNA，即為無義突變抑制性tRNA。抑制性tRNA存在廣泛，無論在植物細胞還是動物細胞中，都發現了抑制性tRNA。但由于抑制性tRNA在細胞中含量極少，因此抑制性tRNA不易被檢測到。