[發明專利]檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒

在審

• 申請號: 201610134295.0
• 申請日: 2016-03-09
• 公開（公告）號: CN105606807A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 余華;楊光友;嚴玉寶
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國四川出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535
• 代理公司: 成都希盛知識產權代理有限公司 51226
• 代理人: 柯海軍;武森濤

1.檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒，包括ELISA板、洗滌液、封被液、酶標二抗、 顯色物、終止液和Di-TCTP蛋白抗原，其特征在于：

所述Di-TCTP蛋白抗原為Di-TCTP基因編碼得到的蛋白，所述Di-TCTP基因序列如SEQ IDNo.1所示；

所述洗滌液為PBST，所述PBST為磷酸鹽吐溫緩沖液；

所述封被液為3wt％牛血清蛋白；

所述酶標二抗為HRP標記的羊抗狗IgG；

所述顯色物為3,3',5,5'-四甲基聯苯胺；

所述終止液為2.5NH₂S0₄。

2.根據權利要求1所述的檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒，其特征在于：所述 Di-TCTP蛋白抗原的制備方法包括如下步驟：

a、從犬惡絲蟲中提取得到RNA，并將其逆轉錄成cDNA；

b、以cDNA為模板，進行PCR擴增，其中，PCR擴增的引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物如SEQIDNo.2所示；所述下游引物如SEQIDNo.3所示；

c、將PCR擴增得到的產物連接到表達載體，得重組表達質粒；

d、將重組表達質粒轉入大腸桿菌BL21中誘導表達，得融合蛋白，過柱純化后，即得 Di-TCTP蛋白抗原。

3.根據權利要求2所述的檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒，其特征在于：

所述PCR擴增體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL， 模板DNA1μL，ddH₂O9.5μL；

PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性35sec，53.8℃退火35sec，72℃延伸35 sec，35個循環；最后72℃延伸10min。

4.根據權利要求2所述的檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒，其特征在于：所述表 達載體為pET-28a(+)。

5.檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，其特征在于，包括如下步驟：

a、用Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板，過夜，再使用PBST徹底清洗四次；

b、將已包被的ELISA板用100μL的3％牛血清蛋白封被1h，再使用PBST徹底清洗四 次；

c、加入待測血清100μL到孔內，室溫處理1h，再加入HRP標記的羊抗狗IgG二抗反應 1h后，使用PBST徹底清洗四次；

d、加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺進行顯色；顯色反應由2.5NH₂S0₄終止，在波長為450nm 的光波下讀取吸光度；

e、根據吸光度值判斷檢測結果。

6.根據權利要求5所述的檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，其特征在于：a步驟所 述的Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板的包被濃度為2.5μg/mL；c步驟所述的HRP標記的羊 抗狗IgG二抗稀釋度為1:5000。

7.根據權利要求5所述的檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，其特征在于：d步驟所 述的顯色時間為5～30min，優選顯色時間為10min。

8.根據權利要求5所述的檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，其特征在于：e步驟所 述的根據吸光度值判斷檢測結果，其判斷方法為：若吸光度值大于或等于0.294，則血清中存 在犬惡絲蟲，若吸光度值小于0.294，則血清中不存在犬惡絲蟲。