[發(fā)明專利]一種熊蜂孢子蟲的PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610133952.X
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105543404B
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張體銀;劉蓓;鄭騰;白泉陽;王武軍;張志燈;于師宇;林素潔
• 申請（專利權(quán)）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明公開了一種熊蜂孢子蟲的PCR檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述PCR反應(yīng)體系中有一對特異性引物Api?F和Api?R，上述引物能夠從感染熊蜂孢子蟲的熊蜂DNA中特異性擴增一段316 bp的片段，從而實現(xiàn)對熊蜂孢子蟲的PCR檢測。本發(fā)明的熊蜂孢子蟲PCR檢測方法，對全基因合成的熊蜂孢子蟲DNA的檢測靈敏度可達到1.39 fg/μL，具有特異性強，穩(wěn)定性好，快速準確的特點，可用于進境熊蜂和國內(nèi)養(yǎng)殖熊蜂體內(nèi)熊蜂孢子蟲的檢測，為防止熊蜂孢子蟲的傳入和國內(nèi)熊蜂孢子蟲病的防控提供可靠的理論和技術(shù)依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熊蜂孢子蟲的PCR檢測方法。

背景技術(shù)

熊蜂孢子蟲（Apicystis bombi）屬于類錐體綱（Conoidasida）、簇蟲亞綱（Gregarinasina）、新簇蟲目（Neogregarinorida）、孢子蟲屬（Apicystis）。熊蜂孢子蟲是一種寄生于熊蜂屬和西方蜜蜂的原生動物寄生蟲，外形與熊蜂微孢子蟲類似但較大，孢子呈船型，大小約11.4-14.4 μm長，3.6-5.4 μm寬。自在芬蘭和意大利出現(xiàn)后，這種寄生蟲很快傳染到歐洲各國，目前國內(nèi)尚沒有熊蜂孢子蟲的報道，但這種寄生蟲致病力強，如不嚴格預(yù)防，隨著商用熊蜂群進出口貿(mào)易往來的加大，將對我國熊蜂的飼養(yǎng)和繁育產(chǎn)生巨大影響。

熊蜂孢子蟲的檢驗主要是解剖觀察和鏡檢觀察，鏡檢觀察主要是取病蜂的脂肪體和中腸組織涂片在甲醇中固定2分鐘，0.25%吉姆薩染色8—12小時后，于光學(xué)顯微鏡下觀察。鏡檢觀察容易漏檢，且易與微孢子蟲病、短膜蟲病等混淆。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種熊蜂孢子蟲的PCR檢測方法，以便準確、靈敏、快速、經(jīng)濟地檢測進口熊蜂及國內(nèi)養(yǎng)殖熊蜂蜂群中的熊蜂孢子蟲。

本發(fā)明提供的熊蜂孢子蟲的PCR檢測方法，具體步驟如下：

利用特異性引物對，對疑似感染熊蜂孢子蟲的熊蜂腹部組織DNA進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，如擴增出316 bp的熊蜂孢子蟲基因片段，則標志著待檢測樣品為熊蜂孢子蟲陽性。

其中，所述特異性引物對為：

上游引物Api-F：5’-AGCGATGGATGTCTTGGG-3’；

下游引物Api-R：5’-TTCAGCGGGTAACCTTGT-3’。

其中，所述PCR的反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)體系總體積為20 μL。

其中，所述PCR 的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min 后進入循環(huán)，95℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

其中，所述凝膠電泳為1.5％瓊脂糖凝膠電泳。

本發(fā)明還提供用于熊蜂孢子蟲的PCR檢測方法的特異性引物對，上游引物為上游引物 Api-F：5’-AGCGATGGATGTCTTGGG-3’；下游引物為Api-R：5’-TTCAGCGGGTAACCTTGT-3’。

本發(fā)明還提供所述熊蜂孢子蟲的PCR檢測方法在進境熊蜂及國內(nèi)養(yǎng)殖蜂群中的應(yīng)用。