[發明專利]一種快速檢測副雞禽桿菌的試劑盒

在審

• 申請號: 201610132798.4
• 申請日: 2016-03-09
• 公開（公告）號: CN105695579A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 王宏俊;徐玉智;李淑芳;龔玉梅;張培君;孫惠玲;徐福洲;周宏專;李永清
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

技術領域

本發明涉及試劑盒檢測技術領域，具體的說涉及一種快速檢測副雞禽桿菌的試劑盒。

背景技術

副雞禽桿菌是細小的革蘭氏陰性菌，細菌長約1-3μm，寬0.4-0.8μm，無鞭毛，不形成芽孢，毒力菌株往往有莢膜。副雞禽桿菌培養條件較為苛刻，需要在培養基中加入NAD，但在南非也發現NAD非依賴性分離株，說明NAD不是必需的營養成分。該菌兼性厭氧，在固體培養基上培養時需厭氧環境或3％-10％的CO₂。基于血凝抑制試驗建立起來Page方法將副雞禽桿菌分為A、B、C三種血清型。副雞禽桿菌引起的疾病叫做雞傳染性鼻炎。病雞精神委頓，垂頭縮頸，食欲明顯降低。最初自鼻孔流出水樣汁液，繼而轉為漿性黏性分泌物，雞只有時甩頭，打噴嚏，眼結膜發炎，眼瞼腫脹，有的流淚，一側或兩則顏面腫脹，部分病雞可見下頜部或肉髯水腫。該病潛伏期短，傳播迅速，短時間內便可波及全群。育成雞表現為生長不良，產蛋雞產蛋量明顯下降，處在產蛋高峰期的雞群產蛋量大幅度下降10％-40％，有時高達70％至完全停產。混合感染時可引起病雞死亡，給養殖業造成了重大的損失。

目前進行細菌分類鑒定中常用的靶基因是16SrRNA，它是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，具有高度的保守性，16srRNA基因檢測技術已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具。副雞禽桿菌的生化反應復雜，不同毒力的菌株會有不同的結果；間接血凝試驗雖是目前最準確有效的方法，但此方法用時較長；PCR檢測方法雖然特異性強，但是需要的PCR擴增儀十分昂貴。因此，發明一種操作簡便、準確快速的檢測副雞禽桿菌的方法對雞傳染性鼻炎預防和治療具有重要意義。

環介導等溫擴增基因技術(loop-mediatedisothermalamplication,簡稱LAMP)(國際專利公開號WO00/28082)是2000年Notomi等開發出的一種核酸擴增新技術，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用鏈置換型DNA聚合酶，能在等溫條件下(60～65℃)，1h內特異地擴增出10⁹-10¹⁰拷貝靶序列，擴增結果可直接對擴增副產物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進行判斷或檢測其濁度，也可用結合雙鏈的熒光染料優選SYBRGreenI染色，即可通過肉眼判定。在保持傳統PCR技術優點的基礎上，進一步提高了反應的特異性，同時縮短了檢測時間。國內外在病原體的檢測方法，利用LAMP方法對多種動物疫病和微生物檢測已有很多報告。

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度和精確度、操作簡便的檢測副雞禽桿菌的試劑盒及其檢測方法。

首先，本發明的第一個技術目的是提供一種高靈敏度、高特異性的用于檢測副雞禽桿菌的LAMP引物組，包括：外引物F3和B3，內引物FIP和BIP，所述的外引物F3和B3的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述的內引物FIP和BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。

在此基礎上，本發明進一步提供一種簡單、快速、準確的檢測副雞禽桿菌的試劑盒，該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、操作簡單的特點。

所述試劑盒為LAMP試劑盒，除了包含上述引物組外，還包括：LAMP緩沖液、BstDNA聚合酶、dNTPs、無菌去離子水、陽性對照和陰性對照。如果采用熒光目視法時，還包括熒光染料。

優選的，本發明的試劑盒中LAMP引物組的濃度為：外引物F3和B3的濃度為5pmol/μL；內引物FIP和BIP的濃度為40pmol/μL。

更為優選的，本發明的試劑盒包括：

1)10×LAMP緩沖液；2)8000U/mLBstDNA聚合酶；3)10mMdNTPs；4)LAMP引物組；5)無菌去離子水；6)熒光染料：10×SYBRGreenI；7)陽性對照：0083、022和Modesto副雞禽桿菌基因組DNA；陰性對照：無菌去離子水。

其中所述的10×LAMP緩沖液含有25℃下pH8.8的200mMTris-HCl、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂、8M甜菜堿和體積百分濃度為1％的曲拉通X-100。