[發明專利]一種防治豬流行性腹瀉病的卵黃抗體及其制備方法

有效

• 申請號: 201610132133.3
• 申請日: 2016-03-09
• 公開（公告）號: CN107177001B
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發明（設計）人: 張美美;張志剛;董劍輝;金忠輝;閆雷;張曉杰
• 申請（專利權）人: 北京大偉嘉生物技術股份有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 劉雅婷

1.一種防治豬流行性腹瀉病的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，制備過程包括以下步驟：

1)擴大培養豬流行性腹瀉病毒(PEDV)：用含10％FBS，1％青鏈霉素的DMEM細胞培養液培養Vero細胞長至單層；用無菌1×PBS洗滌細胞2次，每個底面積225cm²的細胞培養瓶中加入15mL無血清DMEM；取PEDV病毒液按0.1MOI接種于Vero細胞上，并在DMEM中添加胰酶至終濃度3～5μg/mL形成吸附液；于37℃，5％濃度CO₂的條件下吸附1.5h，吸附完成后棄掉吸附液，加入含有濃度為5～10μg/mL胰蛋白酶的無血清DMEM作為維持液，于37℃，5％濃度CO₂的細胞培養箱中培養；連續培養48～72h或細胞病變達80％后，收獲細胞培養物置于-80℃冰箱，反復凍融3次，收集病毒培養物，經8000轉/分鐘離心10分鐘去除細胞碎片即可；

所述豬流行性腹瀉病毒為PEDV/CH/2014株，微生物保藏號為CGMCC No.10111；

2)PEDV病毒的滅活：取步驟1)所得病毒液，加入終濃度0.1％-0.2％的β-丙內酯，充分混合均勻后放置在4℃滅活20h-24h，期間每隔2h搖動一次，滅活完成后置37℃放置2h降解β-丙內酯；

3)免疫接種：采用胸部肌肉多點注射，共免疫4次；將滅活后的病毒液加入等量弗氏完全佐劑乳化成的疫苗作為首次免疫的免疫原，免疫劑量1mL，胸肌多點注射；分別間隔兩周進行二免、三免和四免，且二免、三免和四免均接種弗氏不完全佐劑疫苗，免疫劑量增至1.5mL、2mL、4mL；

4)抗體效價檢測：四免后1周開始每隔1周收集卵黃，利用瓊脂擴散試驗測定卵黃抗體的效價，待效價達到1:64時收集高免蛋；

5)卵黃抗體的提取純化：無菌條件下收集高免卵黃液，加入7倍體積pH5.0的酸化水，邊加邊攪拌，混勻后，于4℃靜置3-4h，取分層后的上清液并離心去除殘留的不溶物；收集離心后上清，待上清恢復至室溫后加入辛酸至體積終濃度0.2％，充分混勻后于室溫靜置3-4h，離心取上清，經超濾濃縮后即為提純的卵黃抗體。

2.一種卵黃抗體，其特征在于，所述卵黃抗體根據權利要求1所述的防治豬流行性腹瀉病的卵黃抗體的制備方法制備而成。

3.根據權利要求2所述的卵黃抗體，其特征在于，根據DNAstar軟件分析，所述PEDV/CH/2014株與豬流行性腹瀉病毒株CV777不在同一進化分支上。