[發明專利]一種基于Fe2O3納米粒子的病毒快速檢測方法

在審

• 申請號: 201610131511.6
• 申請日: 2016-03-09
• 公開（公告）號: CN105784998A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 張錦勝;那美玲;孟雪;田穎剛
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及一種病毒的快速檢測方法。

背景技術

基本原理：單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過共價鍵結合，這種結合不會改變 單克隆抗體、抗原和酶的免疫學特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗 原結合。Fe₂O₃材料具有鐵磁性，當粒子直徑小到一定程度會出現超順磁特性，即沒有外加磁 場時沒有磁性，而在有外加磁場時表現出一定的磁性，可以用于磁分離。因此可以構建順磁 性的特異性Fe₂O₃納米探針生物傳感器來做檢測。

其主要的原理步驟：1.檢測病毒的特異性順磁納米Fe₂O₃探針的制備。從市場上購 買納米Fe₂O₃材料，也可以通過其他方法制備納米級的Fe₂O₃。使用硅烷偶聯劑，其通式為:Y (CH₂)nSiX₃。此處，n為0-3；X為可水解的基團；Y為有機官能團。X通常是氯基、甲氧基、乙氧 基、乙酰氧基等，這些基團水解時即生成硅醇(Si(OH)₃)，而與無機物質結合，形成硅氧烷。Y 是乙烯基、氨基、環氧基、甲基丙烯酰氧基、巰基。這些反應基團可與有機物質反應而結合。 因此，通過使用硅烷偶聯劑，可在無機物質和有機物質的界面之間架起“分子橋”，把兩種性 質懸殊的材料連接在一起提高復合材料的性能和增加粘接強度的作用。通過修飾抗體可實 現表面功能化，形成特異性免疫探針，再封閉多余的活性位點。2.將另一部分病毒的單克 隆抗體固定在酶標板表面，并將多余活性位點封閉。3.將制備的特異性免疫磁珠用于抓取 富集病毒，通過外加磁場將磁珠分離出來，此時，結合了病毒的磁珠和沒有結合病毒的磁珠 還是混在一起。4.將上述混在一起的磁珠，加到第2步的酶標板表面，則抓取了病毒的磁珠 將與酶標板表面單克隆抗體發生特異性結合，形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗可以 將未發生結合的磁珠洗脫。5.再采用洗脫劑將固定載體上的結合的特異性納米免疫磁珠 洗下來，清洗掉離子、溶劑。此部分磁珠如果存在，就是抓取了病毒的磁珠。6.加入硝酸和鹽 酸（1：3體積比）進行硝化反應，這部分磁珠如果存在，則Fe₂O₃轉化為三價鐵離子和二價鐵 離子。通過檢測是否存在鐵離子就可以檢測出樣品中是否存在病毒。通過加標，在一定范圍 內可以定量檢測病毒。該方法的主要優點就是快速、靈敏度相對較高。相對于病毒的微生物 培養2-3天甚至幾天的時間。此方法主要取決于樣品的預處理時間。因此，用該方法可做大 規模待檢樣品的陽性篩選，檢出的陽性樣還需用微生物培養進行確證。該方法的主要優點 就是快速、靈敏度高。因此，用該方法可做大規模待檢樣品的陽性篩選，一定程度上可以定 量檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于Fe₂O₃納米粒子病毒快速檢測方法，用于對各種不同 樣品進行評價，該方法是一種客觀有效的檢出病毒的方法，從而在某種程度上大大縮減了 病毒的檢測時間。

一種基于Fe₂O₃納米粒子的病毒快速檢測方法，通過分離捕獲的免疫磁珠，使其轉 化為鐵離子，提出鐵離子與病毒的相關性指標，通過檢測鐵離子來間接定量病毒。

該方法采用偶聯了特異性單克隆抗體的免疫磁珠，可以將樣品中的病毒進行富 集；通過設計雙抗夾心分離捕獲到病毒的磁珠，再將磁珠硝化反應轉化為三價鐵離子和二 價鐵離子。采用鄰二氮菲吸光光度法、硫氰酸鉀比色法等檢測出鐵離子的量，從而算出磁珠 的量，通過加標定量磁珠而在一定程度間接定量出病毒的量。通過定量分析捕獲病毒的磁 珠含量，從而可以間接定量出食品樣品中的病毒含量。檢測出的病毒含量與磁珠含量線性 相關，擬合度較好。最終以免疫磁珠與病毒間的對應關系為紐帶，確定食品樣品中的病毒的 量。

本發明是這樣實現的，步驟如下。

（1）檢測病毒的特異性免疫磁珠的制備。

（2）將病毒單克隆抗體固定在酶標板表面。