[發明專利]一種從亞麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制劑的方法

在審

• 申請號: 201610131496.5
• 申請日: 2016-03-08
• 公開（公告）號: CN105566491A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 石亞偉;陳穎璐
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/18
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 張福增

技術領域

本發明涉及胰蛋白酶抑制劑的提取，具體是一種從亞麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制劑的 方法。

背景技術

亞麻(LinumusitatissimumL.)是一種亞麻科亞麻屬的一年生草本植物，其種子亞麻籽中 含有多種生物活性的物質，包括亞麻酸、木酚素以及亞麻膠等。其中蛋白質含量可達到 23％-33％，主要為球蛋白和白蛋白，是植物中優質蛋白。因其豐富的油脂含量，亞麻在我國 的應用主要用于榨油，榨油后的亞麻籽粕中主要成分是蛋白類及亞麻籽膠、植酸等。但是這 一資源并沒有得到充分利用，造成了極大的浪費，因此開展對亞麻籽粕的綜合利用，對資源 回收利用將產生重要意義。

胰蛋白酶抑制劑(Trypsininhibitor，TI)是一類可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽， 屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，具有抗病毒、抗腫瘤、抗真菌等活性。廣泛存在于植物、動 物和微生物中。胰蛋白酶類抑制劑最初是由Bowan-Birk從大豆中提取而來。陸續從馬鈴薯、 豇豆、綠豆、苦蕎等作物中提取得到了不同種類的胰蛋白酶抑制劑。但是，從亞麻蛋白粉中 提取胰蛋白酶抑制劑的方法還未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種從亞麻蛋白粉中分離胰蛋白酶抑制劑的方法，該方法應簡便易 操作，對設備要求低，且提取到的胰蛋白酶抑制劑純度高，活性大且穩定性很好，對高溫和 酸性環境具有很強的耐受性。

本發明提供的一種從亞麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制劑的方法，包括如下步驟：

將脫脂后的亞麻蛋白粉，溶于4-6倍體積的pH為8.0的50mMTris-HCl緩沖液中，4℃ 抽提蛋白8-12h，抽提液于高速冷凍離心機13000r/min離心30min后，取上清上樣于經pH為 8.0的50mMTris-HCl緩沖液平衡的陰離子交換柱Q-Sepharose4B柱，收集穿透樣品，濃縮、 干燥后即獲得高純度的亞麻胰蛋白酶抑制劑。

本發明從脫脂亞麻蛋白粉中分離得到的胰蛋白酶抑制劑，分子量約為8kDa。

與現有技術相比本發明的有益效果：

胰蛋白酶抑制劑一般純化過程大都通過鹽析、加熱、再結合柱層析的方法分離，步驟較 復雜。而本發明直接Q-Sepharose4B一步從脫脂蛋白粉中獲得亞麻胰蛋白酶抑制劑，方法簡 單，產物純度高。對亞麻脫脂蛋白粉利用價值的提升(去除營養限制因子胰蛋白酶抑制劑)， 以及胰蛋白酶抑制劑進一步單獨開發利用，提供了途徑。

附圖說明

圖1為蛋白的SDS-PAGE圖，其中：泳道1、亞麻蛋白粗提液，泳道2、Q-Sepharose4B 柱穿透的蛋白樣品，即亞麻胰蛋白酶抑制劑。

具體實施方式

下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。

胰蛋白酶抑制劑的分離提?。喝∶撝蟮膩喡榈鞍追?g加入5倍體積50mMTris-HCl 緩沖液(pH為8.0)4℃抽提蛋白8h。抽提液于高速冷凍離心機13000r/min離心30min后， 取上清上樣于用相同緩沖液平衡陰離子交換柱Q-Sepharose4B柱(購自GE公司)，吸附雜蛋白 后，收集穿透樣品即獲得電泳純的胰蛋白酶抑制劑，進行SDS-PAGE分析(見圖1)

胰蛋白酶活力的測定：依據胰蛋白酶能特異性酶解底物BAPNA,生成顯色物質pNA,在 410nm處有最大吸收峰，而胰蛋白酶抑制劑的加入可阻止胰蛋白酶對BAPNA的酶解，從而 抑制反應后的吸光度值的增加。取一定量的胰蛋白酶抑制劑樣品與0.4mL0.2mg/mL的胰酶(購 自索萊寶公司)在37℃下保溫10min后，加入2mL0.5mg/mL底物BAPNA(購自Sigma公司)， 再于37℃下保溫10min后，加入0.5mL醋酸溶液(w/v為33％)終止反應，在OD₄₁₀下測量吸 光度值。以不加抑制劑樣品為空白對照。37℃下，每分鐘水解BAPNA生成1μM對硝基苯 胺PNA所需要的酶量為一個活力單位。在相同條件下，降低一個酶活性單位所需的抑制劑量， 為一個抑制劑活性單位。亞麻胰蛋白酶抑制劑提取過程中的活力測定見表1。

表1亞麻胰蛋白酶抑制劑提取過程中的活力測定