[發(fā)明專利]一種高純度白喉類毒素原液的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610131369.5
• 申請(qǐng)日: 2016-03-04
• 公開（公告）號(hào): CN105755075A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊盼景;熊細(xì)雙;楊廷潺;周偉偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江衛(wèi)信生物藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02;C07K14/34;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種白喉類毒素原液的制備方法，具體是指用于高效率制備高純度的白喉類毒素原液的一種高純度白喉類毒素原液的制備方法。

背景技術(shù)

白喉類毒素原液，是用于制備白喉疫苗的核心原料，現(xiàn)有技術(shù)白喉類毒素原液的制備方法，采用在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)毒的白喉?xiàng)U菌，經(jīng)活性炭脫色、硫酸銨鹽析和超濾脫鹽步驟進(jìn)行純化，再經(jīng)甲醛脫毒制成白喉類毒素原液，以下將白喉類毒素原液簡(jiǎn)稱為原液；上述工藝中，活性炭脫色過程需2～3天的時(shí)間，用時(shí)長(zhǎng)、效率低，活性炭脫色的一致性差，導(dǎo)致各個(gè)批次原液的色澤存在差異；此外，因活性炭難以從原液中完全去除，致原液的純度難以提高，使原液中存在異物風(fēng)險(xiǎn)；目前，《中國(guó)藥典三部》2015版要求白喉類毒素原液的純度≥1500Lf/mlPN，因此，現(xiàn)有技術(shù)存在制備周期長(zhǎng)、效率低、一致性差、純度難以提高的問題與不足。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題與不足，本發(fā)明在采用活菌培養(yǎng)、甲醛滅活、菌液分離、除菌過濾、超濾濃縮、超濾透析、離子交換脫色、鹽析、脫鹽、甲醛脫毒、除菌過濾的制備工藝，在制備過程中用離子交換器對(duì)制品進(jìn)行脫色的技術(shù)方案，提供一種高純度白喉類毒素原液的制備方法，旨在使白喉類毒素原液的制備，達(dá)到縮短制備周期、提高效率、提高品質(zhì)的一致性、提高純度的目的。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種高純度白喉類毒素原液的制備方法，包括活菌培養(yǎng)、甲醛滅活、菌液分離、除菌過濾、超濾濃縮、超濾透析、離子交換脫色、鹽析、脫鹽、甲醛脫毒、除菌過濾工藝步驟，

所述的活菌培養(yǎng)為步驟一，采用白喉?xiàng)U菌CMCC38007凍干菌種，經(jīng)過兩代改良馬丁培養(yǎng)基復(fù)蘇，再接種于改良林氏培養(yǎng)基進(jìn)行菌種擴(kuò)增，獲得增殖菌，之后，將所述增殖菌移至發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行攪拌通氣培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分鐘，溫度33～36℃，用時(shí)40～50小時(shí)，獲得活菌漿；

所述的甲醛滅活為步驟二，按所述活菌漿體積的0.6％的體積比，向發(fā)酵罐內(nèi)加入質(zhì)量濃度為40％的甲醛溶液進(jìn)行攪拌滅活殺菌，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，用時(shí)1小時(shí)，獲得滅活漿；

所述的菌液分離為步驟三，用E連續(xù)流離心機(jī)對(duì)所述滅活漿進(jìn)行離心菌液分離，去除大部分菌體獲取含毒素的培養(yǎng)液；具體為，開啟E連續(xù)流離心機(jī)，待速度達(dá)到10000轉(zhuǎn)/分鐘，穩(wěn)定2分鐘，將所述滅活漿通過蠕動(dòng)泵泵入E連續(xù)流離心機(jī)進(jìn)行離心菌液分離，蠕動(dòng)泵流速1.5～2升/分鐘，收集流出液獲得漿液；

所述的除菌過濾為步驟四，用設(shè)有0.22μm濾芯的A除菌濾器去除所述漿液中的剩余菌體獲得澄清的除菌漿；具體為，將所述漿液通過蠕動(dòng)泵泵入A除菌濾器，蠕動(dòng)泵流速1.5升/分鐘，收集流出液獲得除菌漿；

所述的超濾濃縮為步驟五，用C超濾器對(duì)所述除菌漿進(jìn)行大小分子溶液分離，去除小分子溶液獲取大分子溶液；具體為，將所述除菌漿移至C超濾器內(nèi)，C超濾器使用30千道爾頓的改良聚醚砜質(zhì)的膜包，簡(jiǎn)稱30kD膜包，所述30kD膜包的進(jìn)口的泵壓壓力為0.1MPa，C超濾器回流口的壓力為0.5MPa，開機(jī)，對(duì)所述除菌漿進(jìn)行大小分子溶液分離濃縮，其中小分子溶液經(jīng)C超濾器的出口排出，大分子溶液經(jīng)C超濾器的回流口返回C超濾器內(nèi)與尚未分離的所述除菌漿混合，再次參與循環(huán)分離濃縮；當(dāng)C超濾器內(nèi)的除菌漿濃縮至原體積的1/10～1/15時(shí)，停機(jī)，停止?jié)饪s，此時(shí)存留在C超濾器內(nèi)的溶液為大分子溶液；

所述的超濾透析為步驟六，在C超濾器中對(duì)所述大分子溶液進(jìn)行超濾透析洗濾，獲得超濾濃縮液；具體為，將磷酸鹽緩沖液注入C超濾器內(nèi)與所述大分子溶液混合，開機(jī)，通過所述膜包對(duì)所述大分子溶液進(jìn)行等體積透析洗濾，待洗濾至電導(dǎo)5～10毫西門子/厘米，pH7.4時(shí)，停止注入磷酸鹽緩沖液，關(guān)機(jī)，停止透析洗濾，獲得超濾濃縮液；所述等體積透析洗濾為注入多少磷酸鹽緩沖液，C超濾器的出口排出多少洗濾廢液，始終保持C超濾器內(nèi)所述大分子溶液的原體積；

所述的離子交換脫色為步驟七，用離子交換器對(duì)所述超濾濃縮液進(jìn)行透析脫色，獲得脫色液；具體為，用蠕動(dòng)泵將所述超濾濃縮液泵過離子交換器，通過離子交換膜對(duì)所述超濾濃縮液進(jìn)行脫色；蠕動(dòng)泵流速為500毫升/分鐘；獲得脫色液；