[發明專利]病原菌樣本分析前預處理液及預處理方法

有效

• 申請號: 201610130232.8
• 申請日: 2016-03-08
• 公開（公告）號: CN105699643B
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 胡征;董俊;楊波
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學;湖北華龍生物制藥有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 余曉雪,王敏鋒

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，涉及一種病原菌樣本分析前預處理液及預處理方法。

背景技術

人類健康和醫學的發展史是一部與各種感染性疾病斗爭的歷史。目前感染性疾病(含傳染病)占人類全部死因25％以上。細菌感染所致的感染性疾病占首位。2014年世界衛生組織發布全球死因數據表明，在列為全球十大死因疾病中，下呼吸道感染、HIV/AIDS、腹瀉病以及結核病分列其中第4、6、7和10位，其中下呼吸道感染、腹瀉病和結核病大多屬于細菌性感染。病原菌的檢查則是臨床確診感染性疾病的主要手段。

目前對于病原菌的檢測方法主要有4類：

一是分離培養法，其是證實感染的“金標準”，但由于有的病原菌如肺炎支原體等，其生長周期極為緩慢，培養周期長，培養條件苛刻，甚至有時由于患者用藥導致病原菌活力較差而導致培養失敗出現假陰性結果等原因導致該法在臨床上的應用受到了較大的限制。

二是血清學方法，即采用酶聯免疫法、膠體金免疫法、微量免疫熒光法和間接血凝試驗等，檢測被檢者血清中病原菌相關抗體的水平，可間接提示病原菌感染的存在。然而，血清學試驗只能提供一種回顧性的診斷，而且有時需要雙份血清。另外，抗體出現的時機不易掌握，兒童、青少年與成人之間又存在特異性抗體的差異，故現有血清學方法的檢測質量也受到一定限制。

三是利用分子生物學技術檢測病原菌DNA的存在，其中最常用的是聚合酶鏈式反應(PCR)，該方法快速、靈敏、特異，是目前研究病原菌感染的重要手段，但由于PCR對實驗設備以及操作要求較高，且易出現假陽性，在我國還不能作為常用的臨床診斷方法。

四是直接檢測病原體相關特異性抗原，以直接證實病原體的感染。該法屬于直接法，其結果可信度高。目前，已公開報道的檢測病原體抗原的方法主要為基于抗體-抗原反應的雙抗夾心ELISA法，間接免疫熒光法，膠體金免疫層析法等。在這些方法中，以膠體金免疫層析法最為突出。免疫膠體金層析是近年來繼放射免疫分析和酶聯免疫分析之后發展起來的一種微量檢測技術，該法利用兩種抗病原菌表面特異性抗原的抗體，分別做為標記抗體及捕獲抗體，利用雙抗夾心的原理，結合層析技術，可對病原菌進行快速檢測(5-10分鐘內)。該法的難點在于制備出能捕獲菌體表面抗原的特異性抗體。事實是，有時能成功找到菌體表面抗原(通常為蛋白質)的胞外結構域，但是由于菌體表面結構的復雜性，如空間位阻等原因，以其制備的抗體并不能高效的結合該抗原，從而降低了該法的檢測靈敏度。因此能用此法檢測的病原菌種類較少，大大限制了該法的應用。

發明內容

針對背景技術中存在的這些技術問題，本發明的目的在于提供一種對病原菌樣本進行分析前預處理液以及預處理方法，以提高基于“抗原-抗體”捕獲反應來直接檢測病原體方法(如膠體金、ELISA等)的靈敏度。

本發明的技術方案是：

一種病原菌樣本分析前預處理液，其特征在于：所述病原菌樣本分析前預處理液包括三羥甲基氨基甲烷、鈣鹽、磷脂酶、溶菌酶以及雙蒸水；所述病原菌樣本分析前預處理液以100毫升計算，所述三羥甲基氨基甲烷的含量是0.0121-0.121克；所述鈣鹽以鈣元素計的含量是0.05-0.5克；所述磷脂酶的含量是0.003-0.03克；所述溶菌酶的含量是0.025-0.1克；所述病原菌樣本分析前預處理液的pH為7.0-8.5。

作為優選，本發明所采用的鈣鹽是可溶性鈣鹽。

作為優選，本發明所采用的鈣鹽是氯化鈣、硫酸鈣或硝酸鈣。

作為優選，本發明所采用的磷脂酶是磷脂酶A1或磷脂酶A2。

一種基于如上所述的病原菌樣本分析前預處理液的制備方法，其特征在于：所述病原菌樣本分析前預處理液以100毫升計算，其制備方法包括以下步驟：

1)稱取三羥甲基氨基甲烷、鈣鹽、磷脂酶以及溶菌酶；

2)將步驟1)稱取得到的原料一起溶于90ml雙蒸水中；

3)以鹽酸調pH至7.0-8.5后再以雙蒸水定容至100ml。

基于如上所述的病原菌樣本分析前預處理液對病原菌樣本分析前進行預處理的方法，其特征在于：所述預處理方法包括以下步驟：

1)采集預處理樣本；

2)將預處理樣本與前述的預處理液進行等體積混合；

3)將步驟2)得到的混合液置于50℃中反應20min，完成預處理。

本發明的有益效果為：