[發明專利]用于大腸桿菌分泌表達重組蛋白的培養基及其制備方法

有效

• 申請號: 201610130056.8
• 申請日: 2016-03-08
• 公開（公告）號: CN105671113B
• 公開（公告）日: 2019-04-30
• 發明（設計）人: 譚昊;甘炳成;彭衛紅;黃忠乾;李小林;唐杰;謝麗源;吳翔
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院土壤肥料研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所(普通合伙) 51124
• 代理人: 高蕓

本發明屬于重組蛋白表達領域，具體涉及一種用于大腸桿菌分泌表達重組蛋白的培養基及其制備方法，本發明培養基中每1000毫升含有：胰蛋白胨12?16克、酵母提取物6?10克、D?山梨醇60?100克、氯化鈉8?16克、D?葡萄糖1?2克、1mol/L Tris?HCl緩沖液(pH7.2)20?100毫升、加去離子水至1000毫升。該培養基可促進大腸桿菌通過信號肽向周質空間分泌重組蛋白，促進周質空間中的重組蛋白通過非特異性分泌途徑進一步釋放到培養基液體中，進而提高大腸桿菌分泌表達重組蛋白的成功率和產量。

技術領域

本發明屬于重組蛋白表達領域，具體涉及一種用于大腸桿菌分泌表達重組蛋白的培養基及其制備方法，該培養基可提高大腸桿菌分泌表達重組蛋白成功率和產量。

背景技術

大腸桿菌表達重組蛋白，是將異源目的蛋白的編碼基因克隆插入pET系列等高表達載體并轉入大腸桿菌細胞內，使大腸桿菌經誘導后大量產生所需的目的蛋白。該技術廣泛應用于酶、抗體、疫苗的工業生產，以及科研院校制備科研用重組蛋白。大腸桿菌表達重組蛋白主要有5種方式：

(1)胞內表達：目的蛋白翻譯后停留于大腸桿菌細胞質內；

(2)膜定位表達：目的蛋白翻譯后經合適的信號肽引導，停留于大腸桿菌內膜上；

(3)周質分泌表達：目的蛋白翻譯后經pelB等信號肽引導，從大腸桿菌細胞質運輸到內外膜之間的周質空間；

(4)培養基分泌表達：經長時間誘導后，已進入周質空間的目的蛋白可進一步經由非特異性分泌途徑穿過大腸桿菌外膜，釋放到周圍的培養基液體中；

(5)包涵體表達：目的蛋白被不正確地折疊，在大腸桿菌細胞質或周質空間中聚集成不可溶的緊致微粒(包涵體)。

這5種蛋白表達方式中，膜定位表達因表達量較低且難以進行后續純化，因此實用價值較低。包涵體表達在大部分情況下導致蛋白質變性并失去其正常功能(失活)，雖然在部分情況下可以通過復性使蛋白質恢復正確構象并恢復部分活性，但復性工作量大且蛋白活性無法100％恢復。胞內表達、周質空間表達和培養基分泌表達的實用性較高，但面臨的共同困難是目的蛋白可溶性不佳，易在細胞質內或周質空間中聚集，轉化為包涵體。雖然可通過共表達可溶性標簽等手段提高目的蛋白的可溶性，但需要切除可溶性標簽的額外步驟。綜上所述，在胞內表達、周質空間表達和培養基分泌表達中提高目的蛋白的可溶性是最常采用的策略。

基于上述應用背景，發明人欲提供一種新的培養基，促進大腸桿菌通過信號肽向周質空間分泌重組蛋白，促進周質空間中的重組蛋白通過非特異性分泌途徑進一步釋放到培養基液體中。

發明內容

本發明所解決的技術問題是提供一種用于大腸桿菌分泌表達重組蛋白的培養基，該培養基可促進大腸桿菌通過信號肽向周質空間分泌重組蛋白，促進周質空間中的重組蛋白通過非特異性分泌途徑進一步釋放到培養基液體中，進而提高大腸桿菌分泌表達重組蛋白的成功率和產量。

本發明培養基中每1000毫升含有：胰蛋白胨12-16克、酵母提取物6-10克、D-山梨醇60-100克、氯化鈉8-16克、D-葡萄糖1-2克、1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.2)20-100毫升、加去離子水至1000毫升。

優選的，本發明培養基中每1000毫升含有：胰蛋白胨16克、酵母提取物10克、D-山梨醇100克、氯化鈉12克、D-葡萄糖2克、1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.2)100毫升、加去離子水至1000毫升。

本發明培養基的制備方法如下：按照上述比例關系配制培養基，然后按照常規方法滅菌即可。

其中，本發明采用的滅菌方法為：采用高壓蒸汽滅菌，即在115℃、0.07MPa壓力下滅菌30分鐘。