[發明專利]單管中多重靶核酸的實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201610129787.0
• 申請日: 2016-03-08
• 公開（公告）號: CN105624311A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 戴立忠;龔小鵬;鄧中平;羅惠賓;文荻琛
• 申請（專利權）人: 湖南圣湘生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京弘權知識產權代理事務所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長明;許偉群

1.單管中多重靶核酸的實時熒光檢測PCR方法，每種病毒靶核酸分別是HBV-DNA，HCV- RNA和HIV-1-RNA，其特征在于，包括如下步驟：

(1)在所述單個PCR反應管中混合樣本核酸，TthDNA聚合酶，H-TaqDNA聚合酶，Mn (OAc)₂，dNTPs，內標，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探針，以及內標上下 游引物和探針，針對所述的各種探針標記有熒光基團和熒光淬滅基團，而且各種探針標記 的熒光基團的檢測波長不同；其中，

所述HBV-DNA上游引物的堿基序列為：SEQIDNO:1

5’-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3’；

所述HBV-DNA下游引物的堿基序列為：SEQIDNO:2

5’-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3’；

所述HBV-DNA探針的堿基序列為：SEQIDNO:3

5’-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3’；

所述HCV-RNA上游引物的堿基序列為：SEQIDNO:4

5’-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3’；

所述HCV-RNA下游引物的堿基序列為：SEQIDNO:5

5’-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3’；

所述HCV-RNA探針的堿基序列為：SEQIDNO:6

5’-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3’；

所述HIV-1-RNA上游引物的堿基序列為：SEQIDNO:7

5’-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3’；

所述HIV-1-RNA下游引物的堿基序列為：SEQIDNO:8

5’-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’；

所述HIV-1-RNA探針的堿基序列為：SEQIDNO:9

5’-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3’；

所述內標探針的堿基序列為：SEQIDNO:10

5’-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3’；

所述內標的擴增子序列的堿基序列為：SEQIDNO:11

5’-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCCAAGT TGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3’；

(2)進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光；

(3)選擇FAM通道檢測HIV-1RNA，ROX通道檢測HCV-RNA，CY5通道檢測HBV-DNA；根據熒光 檢測結果計算出的Ct值判斷是否有HBV-DNA，HCV-RNA和HIV-1-RNA中的一種或幾種病毒靶 核酸存在于樣品。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述內標是競爭性內標，其與HIV共用所述 HIV-1-RNA的上下游引物。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述內標包含在人造病毒顆粒內。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述各種探針標記有不同的熒光基團。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反應條件為：(1)預變性和酶激活， 95℃，1分鐘，循環數為1；(2)逆轉錄，60℃，30分鐘，循環數為1；(3)cDNA預變性，95℃，1分 鐘，循環數為1；(4)變性，退火，延伸及熒光采集，循環數為45，其中變性95℃，15秒；退火，延 伸及熒光采集，60℃，30秒；(5)儀器冷卻，25℃，10秒，循環數為1。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中所述根據熒光檢測結果計 算出的Ct值判斷：FAM通道測定Ct值＜45的樣本為HIV陽性樣本，ROX通道測定Ct值＜45的樣 本為HCV陽性樣本，CY5通道測定Ct值＜45的樣本為HBV陽性樣本。