[發明專利]一種D-乳酸脫氫酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201610127941.0
• 申請日: 2016-03-07
• 公開（公告）號: CN105586323B
• 公開（公告）日: 2019-03-12
• 發明（設計）人: 陳晶瑜;彭星月;韓北忠
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12P7/42
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發明公開了一種D?乳酸脫氫酶突變體及其應用。本發明提供了一種蛋白，是如下1)或2)：1)序列A所示的蛋白質；2)將序列A所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列A衍生的蛋白質；所述序列A為將序列2第307位Met突變為Leu得到的序列。本發明的實驗證明，本發明選擇了來自Sporolactobacillus inulinus的D?LDH744進行突變獲得D?乳酸脫氫酶突變體M307L；該突變體具有高的D?乳酸脫氫酶活性，且比未突變的D?乳酸脫氫酶相比，提高D?LDH以PPA(鹽酸苯丙醇胺)為底物時的酶活。

技術領域

本發明涉及分子生物學和生物工程制備領域，尤其涉及一種D-乳酸脫氫酶突變體及其應用，具體涉及一種D-乳酸脫氫酶的改造及利用休止細胞法高效轉化苯丙酮酸合成D-苯乳酸的方法。

背景技術

苯乳酸是一種小分子化合物，其第二個碳原子是手性碳，因此有兩種對映異構體即D-苯乳酸和L-苯乳酸。苯乳酸被證明能抑制培養基、牛奶和奶酪中的李斯特菌，還能抑制一些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌。苯乳酸被認為是乳酸菌(Lactobacillus)產生的第三代可用于食品體系中的新型抑菌物質，普遍認為D-苯乳酸在抑菌中發揮主要作用。另外，苯乳酸被用于畜牧業，取代抗生素的飼料添加劑，還是丹參素的一種衍生物，用于擴張冠狀動脈。

苯乳酸的合成方法有化學合成法和生物合成法，由于化學合成法技術復雜，反應條件苛刻，對環境污染較嚴重，而且副產物多，所以近幾年逐漸將方向轉移至生物合成法上。生物合成法中的微生物發酵法利用許多種乳酸菌合成苯乳酸，雖然有原料成本低，工藝簡單，操作方便等優點，但是副產物多的缺點導致后期的分離純化較復雜。而休止細胞反應不僅底物專一性強，轉化率高，不易染菌，而且副產物少，分離純化較簡單，在工業化的實現上有廣闊的前景。

NADH依賴的D-乳酸脫氫酶(D-LDH，EC1.1.1.27)可以催化苯丙酮酸(PPA)生成D-苯乳酸(D-PLA)，但是相比較于丙酮酸，天然的D-LDH對于PPA表現出較少的底物特異性，但是底物特異性可以通過酶的修飾來提高。Tokuda(2003)根據來自L.pentosus的D-LDH蛋白三維結構，將距離底物PPA分子C3端較近的氨基酸Tyr52替換成了Leu，這個突變體D-LDH(Y52L)比野生型D-LDH表現出了對PPA更高的底物特異性和催化效率。Ishikura(2005)也證明將Tyr52替換成小的疏水氨基酸可以提高L.pentosus對PPA的親和力和催化效率。Zheng(2013)將來自L.bulgaricus ATCC11842的D-LDH的氨基酸Tyr52和Phe299組合突變成Y52L/F299Y突變體，對PPA的酶活是野生型的83.9倍。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：針對現有技術生物合成法中的微生物發酵法利用許多種乳酸菌合成苯乳酸副產物多的缺點導致后期的分離純化較復雜的不足，提供一種改造后的D-乳酸脫氫酶高效轉化苯丙酮酸合成D-苯乳酸的方法。

本發明提供了一種D-乳酸脫氫酶突變體。

本發明提供的蛋白，為D-乳酸脫氫酶突變體，是如下1)或2)：

1)序列A所示的蛋白質；

2)將序列A所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列A衍生的蛋白質；

所述序列A為將序列表中序列2第307位Met突變為Leu得到的序列。

編碼上述蛋白質的DNA分子也是本發明保護的范圍。

上述DNA分子是如下1)-3)中任一種的DNA分子：

1)編碼區為序列B所示的DNA分子；

2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質的DNA分子；