[發(fā)明專利]一種檢測(cè)農(nóng)作物中三唑酮?dú)埩舻脑嚰埣捌鋺?yīng)用、制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610126944.2
• 申請(qǐng)日: 2016-03-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105785010B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樓小華;何國(guó)書(shū);李明海;羅貴昆;高川川;朱文靜;賈玲玲;孫良政;扶勝;謝體波;黨娟;吳紫潔;令狐克勇;巴金莎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)煙草總公司貴州省公司
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/532
• 代理公司: 貴陽(yáng)中新專利商標(biāo)事務(wù)所52100
• 代理人: 吳無(wú)懼

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)農(nóng)作物中三唑酮?dú)埩舻脑嚰埣捌鋺?yīng)用、制備方法，屬于三唑酮檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

三唑酮(Triadimefon)，1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-α-丁酮，是一種高效、低毒、低殘留、持效期長(zhǎng)、內(nèi)吸性強(qiáng)的三唑類殺菌劑。被植物的各部分吸收后，能在植物體內(nèi)傳導(dǎo)，對(duì)銹病和白粉病具有預(yù)防、鏟除、治療、熏蒸等作用。在實(shí)際生產(chǎn)上三唑酮用途廣泛，常被用來(lái)治療農(nóng)作物白粉病和其他真菌病害。

由于三唑酮對(duì)人體有害，因此各國(guó)對(duì)三唑酮的殘留限量制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。例如煙草中制定了中三唑酮最高殘留限量為5mg/kg。

從現(xiàn)有技術(shù)和相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)看，目前針對(duì)三唑酮?dú)埩舻臋z測(cè)方法主要是儀器方法，最常用的方法是GC-MS，儀器方法具備檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，但是檢測(cè)樣本前處理繁瑣、耗時(shí)，樣品還需提取和凈化處理，同時(shí)儀器檢測(cè)方法需要昂貴的大型儀器和設(shè)備，配備專業(yè)的檢測(cè)技術(shù)人員，所以限制了其應(yīng)用。因此，尋求成本低廉、更為快速的檢測(cè)手段，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種檢測(cè)農(nóng)作物中三唑酮?dú)埩舻脑嚰埣捌鋺?yīng)用、制備方法，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、成本低、制作方便，檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，可以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種檢測(cè)農(nóng)作物中三唑酮?dú)埩舻脑嚰垼悠肺諌|、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊和底板，所述反應(yīng)膜上具有包被有三唑酮偶聯(lián)抗原的檢測(cè)線（T線）和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線（C線），所述結(jié)合物釋放墊包被有三唑酮單克隆-膠體金標(biāo)記物。

所述三唑酮偶聯(lián)抗原是由三唑酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白或人血清白蛋白。

所述三唑酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物是將三唑酮單克隆抗體加入膠體金中得到，其中所述膠體金是由檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制取得到。

所述三唑酮單克隆抗體是用三唑酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，然后將小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)融合、篩選得到。

所述三唑酮半抗原是由三唑酮與鹽酸羥胺在固體氫氧化鉀作催化劑存在下回流得肟產(chǎn)物，肟產(chǎn)物再與馬來(lái)酸酐反應(yīng)得到，其分子結(jié)構(gòu)式為：

。

所述樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次粘貼在底板上，其中所述結(jié)合物釋放墊1/3-1/2被覆蓋于樣品吸收墊下。

本發(fā)明還提供一種制備上述試紙的方法，其包括以下步驟：

1）制備包被有三唑酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；

2）制備具有包被有三唑酮偶聯(lián)抗原的檢測(cè)線和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線的反應(yīng)膜；

3）將1）和2）制備好的結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成試紙。

具體地說(shuō)，步驟包括：

1）半抗原制備：三唑酮與鹽酸羥胺在固體氫氧化鉀作催化劑存在下回流得肟產(chǎn)物，肟產(chǎn)物與馬來(lái)酸酐在吡啶或三乙胺催化下進(jìn)行反應(yīng)，獲得半抗原；

2）將三唑酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，得到三唑酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，即三唑酮偶聯(lián)抗原；

3）用三唑酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)融合、篩選，得到三唑酮單克隆抗體；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；

5）用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；

6）將步驟3）制備的三唑酮單克隆抗體加入步驟5）制備的膠體金中，得到三唑酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；

7）將三唑酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被在結(jié)合物釋放墊上，37℃烘60min后取出，密封并置于干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?/p>

8）三唑酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成檢測(cè)線（T線），并將羊抗鼠抗抗體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線（C線）；

9）將樣品吸收墊用含0.5%牛血清白蛋白（體積百分含量）、pH為7.2、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10）在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊，樣品吸收墊蓋住結(jié)合物釋放墊，最后切成3mm寬的小條，加塑料盒，密封包裝，4-30℃條件下可保存12個(gè)月。

本發(fā)明另外還提供一種應(yīng)用上述試紙檢測(cè)農(nóng)作物中三唑酮?dú)埩舻姆椒ǎú襟E：

（1）樣品前處理；

（2）用試紙進(jìn)行檢測(cè)；

（3）分析檢測(cè)結(jié)果。

本發(fā)明的有益效果是：