[發明專利]一種結核分枝桿菌蛋白HBHA及其表達方法和亞單位疫苗

在審

• 申請號: 201610125298.8
• 申請日: 2016-03-04
• 公開（公告）號: CN105524149A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 滕新棟;朱可;林元;梁潔;陳曉光;于瀅泉;徐翮飛;張瑾;張娟
• 申請（專利權）人: 山東國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;C12N15/31;C12N15/81;A61K39/04;A61K39/39;A61P31/06;C12R1/84
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種結核分枝桿菌蛋白HBHA及 其表達方法和亞單位疫苗。

背景技術

肝素結合血凝素(HBHA)是M.tb、BCG、麻風分枝桿菌(M.leprae)等 表面表達和分泌的一種糖蛋白，可同時出現在菌體和培養液中。HBHA能夠粘 附到上皮細胞和其他非吞噬細胞，有利于M.tb從初次感染部位的體內擴散。

翻譯后修飾對HBHA蛋白的免疫原性有重要影響。天然HBHA免疫小鼠后， 不但能誘導小鼠產生高水平IFN-γ和抗體，并且能夠有效減少感染小鼠的脾、肺 臟荷菌量和病理改變，其產生的免疫效果甚可達到BCG的相應水平。鑒于天然 HBHA在預防結核病方面的重要作用，需要對其進行大規模的純化制備以備進 一步的進行臨床研究應用。但是大規模的純化制備受表達系統的制約，如大腸 桿菌表達系統表達的蛋白HBHA不能進行翻譯后修飾，恥垢分枝桿菌表達的蛋 白HBHA不適宜大規模生產等。

發明內容

針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種畢赤酵母GS115 表達的結核分枝桿菌蛋白HBHA及亞單位疫苗，其目的在于獲取不含有除蛋白 HBHA本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列的結核分枝桿菌蛋白HBHA，并對 其進行大規模的純化制備以備進一步的進行臨床研究應用，配合本發明提供的 疫苗佐劑，用于預防結核病，由此解決了大規模的純化制備受表達系統的制約 的問題。

本發明首先提供一種肝素結合血凝素蛋白(HBHA)，包含有：

1)氨基酸序列為SEQIDNO:1的蛋白質；

2)與序列SEQIDNO:1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％編碼相同 功能蛋白質的氨基酸序列。

上述蛋白質的表達方法，是將核苷酸序列為SEQIDNO:2的基因的的第267 堿基由原先的G突變為A；再將突變后的基因片段插入到畢赤酵母表達載體中， 構成的重組質粒轉入畢赤酵母中進行表達，純化后獲得目的蛋白。

本發明另一個方面提供一種結核病亞單位疫苗，含有所述的HBHA蛋白和 疫苗佐劑；其中HBHA蛋白的濃度為0.25～0.75mg/mL：

所述的亞單位疫苗中脂質體形式的DTM疫苗佐劑的使用濃度如下：0.5～2 mg/ml二甲基雙十八烷基銨、含有0.25～0.75mg/mL的海藻糖，0.25～0.75mg/mL 的單磷酰脂質A；

所述的亞單位疫苗中溶液形式的PTM疫苗佐劑的使用濃度如下：0.25～0.75 mg/mL的海藻糖，0.25～0.75mg/mL的單磷酰脂質A，12.5～37.5mg/mL的聚 乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)。

本發明選利用畢赤酵母GS115菌株能夠表達出的蛋白HBHA無標簽且不含 有除HBHA本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列，配合相應疫苗佐劑能夠取得 下列較好的免疫反應效果，免疫保護效果和高安全性。

附圖說明

圖1：實施例4的PCR鑒定HBHA基因整合于畢赤酵母GS115染色體基因 組和蛋白HBHA的表達純化圖；

圖2：實施例9的各組小鼠血清蛋白HBHA特異的IgG抗體、亞類及 IgG2a/IgG1比值圖；

圖3：實施例9的蛋白HBHA特異的小鼠脾細胞上清中細胞因子IFN-γ水 平圖。

圖4為實施例10的氣溶膠攻擊感染免疫C57BL/6小鼠四周后各組的肺臟荷 菌量圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實 施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅 用以解釋本發明，并不用于限定本發明。此外，下面所描述的本發明各個實施 方式中所涉及到的技術特征只要彼此之間未構成沖突就可以相互組合。

本發明提供的畢赤酵母GS115表達的蛋白HBHA無標簽且不含有除HBHA 本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列。本發明提供的結核病亞單位疫苗，含有 所述的蛋白HBHA，其濃度為0.25至0.75mg/mL，還含有以下兩組成分中的一 組的：

0.5mg/ml至2mg/ml二甲基雙十八烷基銨、含有0.25至0.75mg/mL的海 藻糖，0.25至0.75mg/mL的單磷酰脂質A，為脂質體形式；