[發明專利]一種提高植物甲硫氨酸含量的載體及其構建方法和用途

有效

• 申請號: 201610124998.5
• 申請日: 2016-03-04
• 公開（公告）號: CN105671074B
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 向小利;巫永睿;潘光堂;路史迪克·托馬斯;梅辛·約阿希姆
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院生物技術核技術研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;C12N15/84;A01H5/00;A01H4/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種載體在提高玉米甲硫氨酸和/或半胱胺酸含量的用途，所述載體的核苷酸序列為：將序列表SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列的第8621位至11200位的核苷酸替換為序列表SEQ ID NO.12所示的核苷酸后的核苷酸序列。

2.一種轉基因玉米的培育方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將載體導入農桿菌菌株中，活化，備用；所述載體的核苷酸序列為：將序列表SEQ IDNO.14所示的核苷酸序列的第8621位至11200位的核苷酸替換為序列表SEQ ID NO.12所示的核苷酸后的核苷酸序列；

(2)取授粉13天的玉米HiII雜交種幼胚，用預先活化的農桿菌浸染幼胚；

(3)吸去菌液，把幼胚轉移到共培養基上；20℃共培養三天后轉到恢復培養基上，28℃黑暗培養7天之后把有生長能力的幼胚轉到第一次篩選培養基上，28℃黑暗培養2周，再轉到第二次篩選培養基上，黑暗條件下培養2周；把生長良好的愈傷組織轉到第一次分化培養基上進行分化，28℃黑暗分化3周，再轉到第二次分化培養基上在24℃光照分化，得轉基因玉米植株。

3.根據權利要求2所述的一種轉基因玉米的培育方法，其特征在于，

步驟(1)中活化采用YEP培養基，配方：5g L^-1酵母提取物，10g L^-1蛋白胨，5g L^-1氯化鈉，15g L^-1瓊脂粉，pH 6.8，培養基冷到50℃后加抗生素；

步驟(2)中浸染采用的浸染液配方：N6培養基鹽和維生素，1.5mg L^-1的2，4-D-二氯苯氧乙酸丁酯，0.7g L^-1L-脯氨酸,68.4g L^-1蔗糖,36g L^-1葡萄糖，pH 5.2，乙酰丁香酮100μmolL^-1；

步驟(3)中：共培養培養基配方：N6培養基鹽和維生素，1.5mg L^-1 2,4-D-二氯苯氧乙酸丁酯，0.7g L^-1L-脯氨酸，30g L^-1蔗糖，3g L^-1植物凝膠，pH 5.8，0.85mg L^-1硝酸銀，100μmolL^-1乙酰丁香酮，400mg L^-1半胱氨酸；

恢復培養基配方：N6培養基鹽和維生素，1.5mg L^-1 2,4-D-二氯苯氧乙酸丁酯，0.7g L-1L-脯氨酸，30g L-1蔗糖，0.5g 2-(4-嗎啉)-乙烷磺酸，3g L^-1植物凝膠，pH 5.8，0.85mg L^-1硝酸銀，250mg L^-1噻孢霉素；

第一次篩選培養基配方：N6培養基鹽和維生素，1.5mg L-1 2,4-二氯苯氧乙酸丁酯，0.7g L-1 L-脯氨酸，30g L-1蔗糖，0.5g 2-(4-嗎啉)-乙烷磺酸，3g L^-1植物凝膠，pH 5.8，0.85mg L^-1硝酸銀，250mg L^-1噻孢霉素，1.5mg L^-1雙丙氨膦；

第二次篩選培養基配方：N6培養基鹽和維生素，1.5mg L^-1 2,4-D二氯苯氧乙酸丁酯，0.7g L-1 L-脯氨酸，30g L-1蔗糖，0.5g 2-(4-嗎啉)-乙烷磺酸，3g L^-1植物凝膠，pH 5.8，0.85mg L^-1硝酸銀，250mg L^-1噻孢霉素，3.0mg L^-1雙丙氨膦；

第一次分化培養基配方：MS鹽和維生素，60g L^-1蔗糖，100mg L^-1肌醇，3g L^-1植物凝膠，pH 5.8，250mg L^-1噻孢霉素和3mg L^-1，雙丙氨膦滅菌后加；

第二次分化培養基配方：MS鹽和維生素，100mg L^-1肌醇，30g L^-1蔗糖，3g L^-1植物凝膠，pH 5.8。