[發(fā)明專利]與巖沙海葵毒素特異性結(jié)合的高親和力適配體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610124525.5
• 申請日: 2016-03-04
• 公開（公告）號: CN105647931B
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高順祥;鄭欣;胡波;劉德婧;孫銘娟;焦炳華;王梁華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C07H7/06;C07H1/08;A61K31/7088;A61P39/02;G01N33/53
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一條與巖沙海葵毒素特異性結(jié)合的高親和力適配體，具有如下所示的通式：5′?ACCGACCGTGCTGGACTCA?N₄₂?ACTATGAGCGAGCCTGGCG?3′；其中，N代表堿基A，T，C，G中任一個，N₄₂代表長度為42bp的隨機序列。本發(fā)明基于改良的磁珠SELEX技術(shù)篩選得到一條與巖沙海葵毒素特異性結(jié)合的高親和力適配體。該單鏈DNA適配體可用于樣品中痕量PTX的分離富集，食品中PTX的分析檢測，中和或拮抗PTX藥物的制備，以及水體中PTX的去除。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一條基于改良的磁珠SELEX技術(shù)篩選獲得的與巖沙海葵毒素特異性結(jié)合的高親和力適配體，為海產(chǎn)品中巖沙海葵毒素的快速檢測、水體中毒素的去除、樣品中痕量毒素的分離富集，以及中和或拮抗巖沙海葵毒素毒性藥物的制備奠定了基礎(chǔ)。

背景技術(shù)

巖沙海葵毒素(palytoxin,PTX)是一種從海葵屬軟珊瑚中分離獲得的海洋生物毒素，是迄今為止已知的毒性最強烈的海洋生物毒素之一。PTX常存在于熱帶和亞熱帶的水域中，并可通過水生食物鏈在魚類或蟹類體內(nèi)蓄積，人類誤食這些染毒的水產(chǎn)品后會引起食物中毒。中毒癥狀主要表現(xiàn)為呼吸困難、呼吸衰竭、運動失調(diào)、四肢無力、消化道廣泛出血、休克或死亡等。PTX毒性強烈，作用速度極快，對家兔的半數(shù)致死量LD50為25ng/kg，從中毒到死亡的時間僅3～5分鐘。PTX中毒沒有特效藥，臨床目前主要是采取催吐、洗胃和活性炭胃內(nèi)毒素吸附等有限的治療的手段。隨著有害赤潮的不斷加劇以及人類對海鮮產(chǎn)品愈發(fā)的熱衷，加大對海洋生物毒素的監(jiān)控力度，加強海產(chǎn)品檢測新技術(shù)的開發(fā)，特別是研究建立特異性強、靈敏度高、現(xiàn)場高效快速的巖沙海葵毒素的檢測方法，對于進一步完善我國食品衛(wèi)生檢驗標(biāo)準(zhǔn)體系，提高食品的衛(wèi)生質(zhì)量，保障人們生命安全，具有十分重要的重要意義。

目前對巖沙海葵毒素檢測最權(quán)威的是小鼠生物法，但這種方法特異性差、靈敏度低，同時涉及倫理道德等問題已不主張使用。高效液相色譜法(HPLC)是毒素檢測中運用最為廣泛、技術(shù)比較完善的一種檢測方法，可以和多種儀器聯(lián)和使用，大大提高了檢測的靈敏度和特異性。然而，該方法耗時長、樣品前處理繁瑣、儀器昂貴等問題而難以普及。免疫分析法特別是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是一種靈敏度高、特異性好、可實現(xiàn)現(xiàn)場快速分析的方法，在食品安全、生物毒素檢測領(lǐng)域已較為廣泛地應(yīng)用。該技術(shù)的核心是制備高靈敏性和高特異性的抗體，但是由于抗體的制備過程復(fù)雜，儲存條件苛刻，穩(wěn)定性差等問題很大程度上限制了該技術(shù)在PTX檢測中的應(yīng)用。

適配體是一種功能類似于抗體的單鏈DNA或RNA分子，是通過體外篩選技術(shù)SELEX(指數(shù)富集性配體系統(tǒng)進化，Systematic Evolution of Ligands byExponentialEnrichment)從寡核酸文庫中獲得的核苷酸序列。與抗體相比，適配體作為一種新型的分子識別元件具有明顯的優(yōu)越勢，例如：不需要免疫動物可體外合成，易于標(biāo)記和修飾，免疫原性低，穩(wěn)定性高，組織滲透性強等。這些特性使適配體在分析診斷領(lǐng)域，醫(yī)藥研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。近年來已有學(xué)者將適配體應(yīng)用于海洋生物毒素檢測領(lǐng)域，同生物傳感器平臺結(jié)合，研發(fā)了許多快速、新穎的檢測方法而備受關(guān)注。

然而，關(guān)于與PTX特異性結(jié)合的分子識別探針，與PTX特異性結(jié)合的高親和力適配體，以及該適配體的親和常數(shù)鑒定、優(yōu)化及應(yīng)用尚無相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一條與巖沙海葵毒素特異性結(jié)合的高親和力適配體及其應(yīng)用。本發(fā)明的第二目的是提供上述適配體在制備樣品中痕量巖沙海葵毒素的分離富集試劑中、在制備巖沙海葵毒素檢測試劑或試劑盒中、在制備預(yù)防或治療巖沙海葵毒素中毒藥物中，以及在制備去除水體中巖沙海葵毒素制劑中等多方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的主要技術(shù)方案是：基于改良的磁珠SELEX技術(shù)篩選得到一條與巖沙海葵毒素特異性結(jié)合的高親和力適配體。該單鏈DNA適配體可用于樣品中痕量PTX的分離富集，食品中PTX的分析檢測，中和或拮抗PTX藥物的制備，以及水體中PTX的去除。