[發明專利]重組菌株及其制備方法、應用

有效

• 申請號: 201610119394.1
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105734004B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 胡丹;趙麗彬;方真;刁劉洋;毛賢軍
• 申請（專利權）人: 廊坊梅花生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及重組菌株及其制備方法、應用。本發明所構建的L?賴氨酸基因工程菌能夠實現發酵過程中L?賴氨酸的有效積累，且具有較高的糖酸轉化率。本發明從頭構建的基因工程菌株，避免了隨機突變帶來的副作用，有利于實現高產酸和高轉化率，具有廣泛的工業應用前景。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及重組菌株及其制備方法、應用。

背景技術

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)是革蘭氏陽性微生物，具有生長速度快、非致病、對自身代謝物弱降解能力的特性。作為傳統工業微生物，谷氨酸棒桿菌廣泛用于生產L-氨基酸、核苷酸及其他有機酸。

L-賴氨酸是世界上第二大氨基酸生產品種,廣泛應用于動物飼料、醫藥和食品工業。其中約90％用于飼料工業，10％用于食品和醫藥行業。用于動物飼料添加劑，L-賴氨酸可幫助機體吸收其他氨基酸，從而提高飼料質量。

谷氨酸棒桿菌合成L-賴氨酸，從L-天冬氨酸開始，經過六步酶催化得到L-賴氨酸。L-賴氨酸的產率與生物合成途徑中的酶活性及代謝流的分布相關，通過增強末端合成途徑的酶活性，或改變中央代謝流方向，以及增加還原力的供給，都利于菌株高產L-賴氨酸。

天冬氨酸激酶(lysC編碼)作為末端合成途徑的第一個關鍵酶，受到該途徑產物L-賴氨酸的反饋抑制。J.Ohnishi等(J.Ohnishi.Appl Microbiol Biotechnol.2002,58:217-223)以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032為出發菌株，通過引入點突變，解除了lysC的反饋抑制，突變菌株可積累55g/L L-賴氨酸。高絲氨酸脫氫酶(hom編碼)是蘇氨酸支路的第一個關鍵酶，通過引入點突變，弱化該酶活性，可以減少碳源流向蘇氨酸分支途徑。丙酮酸羧化酶(pyc編碼)是回補途徑關鍵酶，增強該酶活性，可以為L-賴氨酸合成提供更多前體。經過3基因改造，J.Ohnishi等獲得的基因工程菌株APH-3可積累L-賴氨酸達80g/L。

還原力的供給在L-賴氨酸合成中非常重要。Masato Ikeda等(Ikeda.J IndMicrobiol Biotechnol.2006,33:610-615)以AHP-3為出發菌株，通過引入點突變，提高6-磷酸葡糖酸脫氫酶(gnd編碼)活性，所獲菌株APG-4可積累L-賴氨酸90g/L。繼續引入點突變，弱化蘋果酸：醌氧化還原酶(mqo編碼)，所獲菌株AGM-5可積累L-賴氨酸100g/L。

隨著代謝工程技術的發展，從頭構建基因工程菌株已應用于工業生產。從頭構建的基因工程菌株，其代謝流向更加精準明確，物質與能量平衡更加完美，有利于實現菌株的高產酸和高轉化率。

傳統誘變和傳統代謝工程菌株具有高產酸和高轉化率的特性，一定時期內，作為氨基酸生產菌株得到了廣泛的應用。但菌株中潛在的未知的隨機突變，對菌株生長及產物合成都有一定的副作用。進一步的菌株代謝操作及工藝控制都無法優化到最完美的狀態，菌株始終無法達到其最高轉化率。

發明內容

有鑒于此，本發明提供重組菌株及其制備方法、應用。本發明從頭構建一株基因工程菌株，避免了隨機突變帶來的副作用，有利于實現高產酸和高轉化率。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種重組菌株，其包含編碼突變lysC蛋白質的突變lysC基因；所述突變lysC蛋白質具有T311I突變。

在本發明的一些具體實施方案中，所述重組菌株還包括編碼突變hom蛋白質的突變hom基因；所述突變hom蛋白質具有V59A突變。

在本發明的一些具體實施方案中，所述重組菌株還包括突變dapA基因、突變dapB基因、突變ddh基因中的一個或多個；所述突變dapA基因、突變dapB基因、突變ddh基因為增強dapA基因、dapB基因和/或ddh基因的表達。