[發(fā)明專利]DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610119096.2
• 申請(qǐng)日: 2016-03-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105648537B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸星宇;宋艷群
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海易畢恩基因科技有限公司;上海易畢恩生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)DNA的提純與片段化預(yù)處理：

將目的DNA提取后使用機(jī)械力或消化酶將其打斷至平均50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度到10000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段；

(2)微量DNA的修復(fù)與接頭引物連接：

將預(yù)處理的DNA片段修復(fù)并與二代測(cè)序需要的測(cè)序接頭引物連接；

(3)共價(jià)標(biāo)記5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶：

將連接好接頭引物的DNA片段中的5位修飾的胞嘧啶進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記；

(4)固相富集含有標(biāo)記的5位修飾胞嘧啶的DNA片段：

將標(biāo)記的5位修飾的胞嘧啶的DNA片段在結(jié)合緩沖液中結(jié)合到固相上，對(duì)固相表面進(jìn)行反復(fù)洗滌，去除未結(jié)合的DNA片段，

(5)在固相上，用對(duì)應(yīng)接頭引物的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，取得的PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化后即得到二代測(cè)序所需的基因組5位修飾胞嘧啶的分布圖譜。

2.如權(quán)利要求1所述的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法，其特征在于：

其中，步驟(1)中，所述DNA片段來(lái)源于體液中游離的DNA片段；或提純于組織、細(xì)胞及細(xì)胞器的完整的基因組DNA。

3.如權(quán)利要求2所述的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法，其特征在于：

步驟(1)中，DNA片段的體液來(lái)自于血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁或者胰腺液。

4.如權(quán)利要求1所述的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法，其特征在于：

其中，上述步驟(2)中的DNA片段修復(fù)是指修復(fù)DNA片段中的堿基損壞，并將DNA的5’及3’補(bǔ)齊成平末端。

5.如權(quán)利要求1所述的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法，其特征在于：

步驟(3)中，標(biāo)記的方法包括步驟：i)利用轉(zhuǎn)糖酶將帶有疊氮基團(tuán)修飾的糖共價(jià)連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上，ii)將直接或間接連有生物素的點(diǎn)擊化學(xué)底物與疊氮糖修飾的5-羥甲基胞嘧啶反應(yīng)。

6.如權(quán)利要求5所述的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法，其特征在于：

所述轉(zhuǎn)糖酶包括但不限于βGT、αGT及其重組酶；疊氮基團(tuán)修飾的糖包括但不限于6-N3-葡萄糖或其他疊氮修飾的糖類。

7.如權(quán)利要求5所述的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法，其特征在于：

標(biāo)記甲基胞嘧啶的步驟為i)利用鼠Tet氧化酶或其重組酶將甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶ii)同權(quán)利要求5所述步驟(3)將5-羥甲基胞嘧啶進(jìn)行生物素標(biāo)記。

8.如權(quán)利要求1所述的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法，其特征在于：

其中，5-羥甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的標(biāo)記步驟可以按順序進(jìn)行也可以在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行。

9.如權(quán)利要求1所述的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法，其特征在于：

其中，步驟(4)中，固相材料包括直徑1nm至100um的磁性小球，直徑1nm至100um的瓊脂糖小球，直徑1nm至100um的人工高分子小球，帶有表面修飾的硅片或其他生物芯片。

10.如權(quán)利要求1所述的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測(cè)序方法，其特征在于：

在步驟(5)中，在固相上擴(kuò)增采用直接在固相上經(jīng)1-40個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增得到合格的測(cè)序文庫(kù)，或經(jīng)1-40個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增后分離固液相再經(jīng)1-40個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增得到合格的測(cè)序文庫(kù)。