[發明專利]一種高溫糖苷水解酶CoGH1A基因及其表達蛋白與應用

在審

• 申請號: 201610119080.1
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105543255A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 韓業君;彭小偉
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/11;C12N1/21;C12P19/14;C12P19/04;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;侯瀟瀟

技術領域

本發明屬于生物技術、生物質利用和食品領域，具體涉及一種高溫糖苷水解酶基 因及其表達蛋白與應用。

背景技術：

糖苷水解酶是水解兩個糖分子或糖分子與非糖分子之間糖苷鍵的一類酶。糖苷水 解酶廣泛應用于生物和化學產業，如食品、飲料、飼料、醫藥、化工、服裝和造紙等領域。其 中，纖維素酶由于生物質產業的迫切需求而受到最為廣泛的重視。另外，有些糖苷水解酶具 有轉糖苷作用，用于合成低聚糖和苷類物質，如一些半乳糖苷酶能利用乳糖合成低聚半乳 糖，有些β-葡萄糖苷酶能利用醇和糖合成烷基糖苷。低聚半乳糖具有保濕性良好、甜度低、 熱能低(非消化)、對酸和熱穩定等特性，它能促進腸道益生菌(雙歧桿菌)的生長，促進脂類 代謝等，有重要保健作用和醫用價值，在功能食品領域受到廣泛的關注，被廣泛應用在保健 品、乳品工業、糖果、飲料等領域。而烷基糖苷是一種重要的化工原料。總體而言，目前糖苷 水解酶存在催化效率低、穩定性不足、應用成本高等問題，限制了相關產業的發展，開發高 效、穩定的糖苷水解酶是生物、化工和食品等產業的迫切需求。極端高溫菌長期生活在高溫 環境，形成獨特的酶體系，其分泌的酶有耐熱性強、催化效率高、催化機理獨特等特點，高溫 糖苷水解酶的開發將加快生物和化工相關產業的發展。本發明提供一種高效多功能高溫糖 苷水解酶基因及表達產物。該酶在75℃下水浴12h其酶活仍保持100％，表現出極強的熱穩 定性，該酶同時具有β-葡萄糖苷酶、纖維素外切酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶和低聚半乳 糖合成酶活性，其中β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性分別接近和超過文獻報道的最高 值。該酶與商業纖維素酶協同水解秸稈，能明顯提高葡萄糖和木糖產率；催化低聚半乳糖 (GalOS)合成速率是文獻報道的10-15倍，達265.2gL-1h-1，具有潛在的工業應用價值。

發明內容

發明目的：

本發明的目的是針對現有糖苷水解酶存在熱穩定性差、催化效率低、使用成本高 等問題，提供一種高溫糖苷水解酶CoGH1A基因及其表達蛋白與應用，包含高溫糖苷水解酶 CoGH1A基因、基因的重組載體和重組工程菌、高溫糖苷水解酶CoGH1A氨基酸序列經過一個 或多個氨基酸殘基取代、缺失及添加形成的具有糖苷水解酶活性的衍生蛋白質，以及該糖 苷水解酶的蛋白表達和應用。具體包括如下：

1、一種高溫糖苷水解酶CoGH1A的基因，其基因序列如SEQIDNO.1所示。

2、一種高溫糖苷水解酶CoGH1A，其氨基酸系列如SEQIDNO.2所示。

3、高溫糖苷水解酶CoGH1A氨基酸序列SEQIDNO.2中的氨基酸經過一個或多個氨 基酸殘基取代、缺失及添加形成的具有糖苷水解酶活性的衍生蛋白質。

4、一種用于擴增高溫糖苷水解酶CoGH1A基因的方法，其特征在于所使用的引物 為：

PX130015’-GCCGCGCGGCAGCATGAGTTTTCCAAAAG-3’

PX130025’-GCGGCCGCAAGCGTTTATGAATTTTCCTTTATATAC-3’

5、一種高溫糖苷水解酶CoGH1A基因序列的重組載體pET-28b-CoGH1A及其轉化而 得的重組工程菌株，所述菌株為大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)。

6、本發明提供制備上述高溫糖苷水解酶CoGH1A表達和純化的方法。

7、高溫糖苷水解酶CoGH1A在生物質水解中的應用，與商業纖維素酶協同水解，能 同時提高葡萄糖和木糖的得率。

8、高溫糖苷水解酶CoGH1A在乳糖水解和低聚半乳糖合成中的應用。它能迅速分解 牛

奶中的乳糖，利用乳糖合成低聚半乳糖的合成速率是文獻報道的10-15倍。

技術方案：

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

(1)高溫糖苷水解酶CoGH1A基因重組載體和重組工程菌的構建

提取熱解纖維素菌C.owensensis的基因組，設計引物分別PCR擴增高溫糖苷水解 酶CoGH1A的基因，再酶切連接到載體pET-28b上，轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，篩選并通 過測序鑒定陽性重組載體，提取重組載體質粒，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，獲得 還有重組載體的重組工程菌。

(2)上述高溫糖苷水解酶CoGH1A的蛋白純化和酶學活性測定