[發(fā)明專利]一種兩核苷酸實時合成測序檢測堿基連續(xù)突變序列的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610119000.2
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105648084B
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發(fā)明（設計）人: 肖鵬峰
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

本發(fā)明提供一種兩核苷酸實時合成測序檢測堿基連續(xù)突變序列的方法，這里，堿基連續(xù)突變序列是指序列中相鄰位置兩個或者兩個以上堿基發(fā)生單堿基序列突變，具體步驟為：（1）制備待測序列的單鏈DNA模板；（2）將測序引物與單鏈DNA模板結合；（3）對待測序列進行兩核苷酸合成焦磷酸測序反應，通過有選擇的幾種具體的兩核苷酸交替加入，完成連續(xù)的多個兩核苷酸實時合成測序反應。該步驟中，根據(jù)分析樣本所有可能的突變序列，設計兩核苷酸加入類型和順序，使得每一種具體的突變類型均有唯一、特征的不同測序圖譜，然后按照設計的兩核苷酸加入類型和順序對分析樣本進行合成測序，比較測序圖譜、確定突變類型。

技術領域

本發(fā)明涉及一種低成本單堿基核酸序列連續(xù)變化的實時合成測序檢測方法，尤其涉及一種從可能的多位點變化中確定具體單堿基變化檢測方法，屬于生物技術領域。

技術背景

隨著人類基因組計劃和各種模式生物基因組計劃的開展和完成，使人類步入了后基因時代，對當代的生物學研究和醫(yī)學研究產生了巨大的影響，分子生物學相關學科得到了迅猛的發(fā)展。從基因水平上認識生命的差異，疾病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，以及藥物與生命體的相互作用將成為可能。就基因序列分析而言，后基因時代的重點已由全基因組序列測定轉移到了對基因組中個體遺傳差異及物種間遺傳差異的比較。在諸多基因變異中，突變和SNP是研究基因遺傳與變異時一種高效的量化標志。通過獲得與該疾病相關基因信息，對疾病預防、用藥選擇、新藥研發(fā)、疾病預后等諸多個體化醫(yī)藥學領域具有十分關鍵的影響。因此，生物科技緊接著面臨如何快速、可靠地對已知突變和SNP位點進行檢測的問題，因此，這將標記著巨大的商業(yè)機會蘊涵在其中，并成為為眾多商家看好的潛在的巨大市場。

與為數(shù)有限的蛋白質測序和DNA序列分析方法相比，基因突變(包括SNP)分析的基本方法在數(shù)量上已達20余種。種類繁多的分析方法，既反映了研究基因突變(包括SNP)分析方法在生物學和醫(yī)學領域所受到的重視程度，也反映出任一單個方法尚無法滿足后基因時代對基因突變(包括SNP)分析的要求。目前絕極大部分的分析方法均是針對單個位點進行分析，對于間隔很近的連續(xù)多個變化序列大部分的技術均無能為力，而這種堿基連續(xù)變化的序列數(shù)量也很多。例如Kras基因編碼12、13位點的序列，對于所有人而言，除了正常序列外，還有7種突變的序列。然而，對于具體的一個人而言，它可能是只有一種正常(未突變)的DNA序列，或者除了正常(未突變)一種DNA序列外、還有一種突變(七種中可能的一種)DNA序列。因此，對一個具體樣本而言，如何從8種可能的類型中快速、準確的判斷出具體的分型，對于臨床診斷無疑是有積極意義的。現(xiàn)有的分析方法中，Sanger測序無疑是這類核酸序列分析的“金標準”，但在定量分析上對豐度低于10％的核酸片段也無能為力；另外，其相對復雜的操作、儀器及其使用價格的相對昂貴也很難進行臨床檢測推廣。DNA芯片組合延伸檢測堿基連續(xù)突變的方法(肖鵬峰，等.中國發(fā)明專利：ZL 201210128598.3)雖然能對這類序列進行并行分析，但DNA芯片制備耗時過長，其總操作時間超過10小時，這樣這個方法只適合大樣本的科研分析，而不適合快速諸如臨床診斷類的分析。焦測序技術是繼Sanger測序后的測序技術，相對于Sanger測序，除了測序長度處于弱勢外，在自動化程度，操作簡易、價格上均有優(yōu)勢，便宜、且檢測限更低，容易推廣、十分適合臨床檢測上使用。現(xiàn)有的焦測序技術原理上如果能夠通過優(yōu)化核苷酸的加入順序，使每種類型具有唯一、特征的測序圖譜也就能夠完成對這類序列的分析。然而，現(xiàn)有焦測序單個核苷酸的加入方式一方面由于受到單體(及其四個單體試劑倉)的限制，根據(jù)不同的序列很難優(yōu)化出符合要求的單核苷酸加入順序，另一方面即使優(yōu)化出符合要求的加入順序，其反應次數(shù)也可能很多，增加了分析的費用。

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術分析堿基連續(xù)突變序列的不足，提出一種兩核苷酸實時合成測序檢測堿基連續(xù)突變序列的方法，通過設計兩核苷酸加入類型和順序，使每一種具體的突變類型均有唯一、特征的不同測序圖譜，從而確定分析樣本的具體突變類型。該方法能夠通過一次測序操作將樣本在可能發(fā)生連續(xù)多個單堿基突變的某個具體突變確定，簡化了操作步驟，減少分析費用。

發(fā)明內容