[發明專利]一種基于組胺受體3分子探針的藥物活性成分篩選方法

在審

• 申請號: 201610118510.8
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105671119A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 徐天瑞;楊洋;劉瑩;郭景明
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N15/62;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京國智京通知識產權代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

1.一種基于組胺受體3分子探針的藥物活性成分篩選方法，其特 征在于，所述的篩選方法包括了以下步驟：

步驟1：構建組胺受體3分子探針：

A.采用Clontech試劑盒，將人組胺受體3的cDNA連接到實驗室現 有載體pcDNA5/FRT/TO-VSV-G-eCFP上，從而得到pcDNA5/FRT/TO-VSV- 組胺受體3-eCFP質粒；

B.用Clontech試劑盒將eYFP的cDNA連接到受體第三內環中部， 從而得原始的分子探針質粒；

C.用探針質粒轉染HEK293細胞48小時,以表達受體分子探針， 并用市售的受體激動劑激活探針，用Olympus高速熒光顯微鏡監測 探針的靈敏度；

D.根據探針靈敏度的監測結果，對探針進行結構優化；

步驟2：建立誘導表達G蛋白偶聯受體分子探針的Flp-InT-Rex HEK293細胞系：

A.將優化后的分子探針質粒和pOG44載體共轉染Flp-InT-Rex HEK293細胞,并用200ug/mlHygromycin篩選陽性細胞克隆；

B.用1ug/mlDoxycycline誘導細胞表達相應的G蛋白偶聯受 體分子探針，用VSV抗體檢測探針蛋白的表達，用熒光顯微鏡監測 分子探針的細胞定位；

C.用受體激動劑處理已經表達的受體分子探針Flp-InT-Rex HEK293細胞，得到不同激動劑劑量的受體激活的FRET曲線，并在停 止給藥后繼續用生理鹽水洗脫激動劑。

2.如權利要求1所述的一種基于組胺受體3分子探針的藥物活性 成分篩選方法，其特征在于：所述的步驟1中對探針進行結構優化具 體如下：

調整eYFP在受體第三內環的位置：將受體第三內環分別截短至兩端 各保留12個氨基酸，優化前探針的eYFP位于受體第三內環的中間位 置，優化后探針的eYFP位于受體第三內環的230-347位置，eCFP位 于受體C-末端的445位置。