[發明專利]一種從紫草中分離制備具有神經氨酸酶抑制活性的化合物的方法

有效

• 申請號: 201610118276.9
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105622374B
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 趙恒強;張敏敏;王曉;閆慧嬌;王岱杰;耿巖玲;于金倩
• 申請（專利權）人: 山東省分析測試中心
• 主分類號: C07C46/10
• 分類號: C07C46/10;C07C50/32;C07C67/48;C07C69/18;C07C69/30;C07C69/533;A61P31/16
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司37221
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種從紫草中分離制備具有神經氨酸酶抑制活性的化合物的方法。

背景技術

流感(流行性感冒)是由流感病毒引起的急性呼吸道感染，具有傳染性強，發病率高，容易引起暴發流行或大流行等特點。特別是近年來，新型流感不斷爆發，給人類健康帶來了嚴重的危害。神經氨酸酶是流感病毒表面一種重要的病毒表面糖蛋白，具有糖苷外切酶活性，可以水解唾液酸(sialicacid)殘基與鄰近寡糖之間的α-糖苷鍵。協助成熟流感病毒脫離宿主細胞感染新的細胞，在流感病毒的生活周期中扮演了重要的角色，因而神經氨酸酶是流感治療藥物的主要作用靶點之一。神經氨酸酶抑制劑(neuraminidase，NA)是目前各國普遍采用治療流感的藥物。然而，已有的抗流感藥物仍然存在數量少、療效不理想且不良反應較大等特點，急需開發高效，低毒，天然的新型神經氨酸酶抑制劑。

紫草(Lithospermiun erythrorhizon)是紫草科(Boraginaceae)植物新疆紫草(Amebia euchroma(Royte)Johnst.)或內蒙紫草(Arnebia guttata Bunge)的干燥根，在我國有悠久的藥用歷史。其味甘、咸，性寒，歸心、肝經。有活血涼血，清熱，解毒、透疹等功效。到目前為止，還沒有從紫草中發現神經氨酸酶抑制劑并以其為指標對紫草進行質量控制的報道。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種從紫草中分離制備具有神經氨酸酶抑制活性的化合物的方法。

為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：

一種從紫草中分離制備具有神經氨酸酶抑制活性的化合物的方法，步驟如下：

(1)以石油醚作為提取溶劑，制備得到紫草提取液；

(2)將紫草提取液與神經氨酸酶混勻，孵育，孵育后超濾離心，離心后加入甲醇使酶變性，釋放出結合的化合物，HPLC檢測；以變性神經氨酸酶作為對照，通過對比HPLC圖譜篩選出具有神經氨酸酶抑制活性的化合物；

(3)利用半制備色譜制備篩選出的具有神經氨酸酶抑制活性的化合物。

步驟(1)中，所述紫草提取液的制備方法為：將紫草與石油醚按料液比為1:80-1:120，優選為1:100，混合，超聲提取20-40min(優選為30min)后，蒸干濾液，用乙醇和MES緩沖液復溶后過膜待用，作為紫草提取液。

步驟(2)中，紫草提取液和神經氨酸酶加入的體積比為1:4-6，優選為1:5。本發明綜合考慮到紫草的提取溶劑對酶反應的影響以及反應體系中神經氨酸酶的終濃度，確定紫草提取液和神經氨酸酶加入的體積比為1:4-1:6；當體積比高于1:4時，神經氨酸酶濃度較低,篩選效果不明顯；體積低于1:6時，反應體系中活性成分含量過低與神經氨酸酶結合差異較小，均不利于篩選的進行。

步驟(2)中，孵育的條件為：37℃恒溫孵育30min。

步驟(2)中，所述超濾離心的操作為：將紫草提取液和神經氨酸酶反應后的溶液移至超濾離心管中，所述超濾離心管的截留分子量為100KD，7000-9000r/min離心5-10min，再用MES緩沖液離心沖洗，以除去未結合的小分子。

步驟(2)中，篩選具有神經氨酸酶抑制活性的化合物的方法為：通過對比紫草提取液與神經氨酸酶反應后的HPLC圖以及紫草提取液與變性神經氨酸酶反應后的HPLC圖，HPLC圖譜發生明顯變化的色譜峰所對應的化合物即為潛在的神經氨酸酶抑制劑。

步驟(3)中，所述半制備色譜的制備條件為：紫草提取液的進樣量為400-600μL，乙腈：水＝80:20作為洗脫流動相，流速為5-7mL/min，檢測波長為280nm。

步驟(3)中，半制備色譜的色譜柱優選為Shim-pack Prep-ODS(H)KIT色譜柱。

上述方法中，提取溶劑的選擇對制備得到的紫草提取液的活性影響很大，本發明在試驗過程中選擇了多種提取溶劑對紫草進行提取，將不同提取溶劑得到的紫草提取液進行體外酶活驗證，結果發現，不同提取溶劑得到的紫草提取液對神經氨酸酶的抑制活性差別顯著，以石油醚作為提取溶劑得到的紫草提取液，其對神經氨酸酶的抑制活性最高，達45.67±0.71％以上。說明以石油醚作為提取溶劑可以對紫草中的具有神經氨酸酶抑制活性的化合物進行有效的提取。

采用本發明的方法可以制備得到五種具有神經氨酸酶抑制活性的化合物，分別為阿卡寧、乙酰阿卡寧、異丁酰阿卡寧、β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰阿卡寧。化合物的結構式如下：