[發明專利]一種銅綠假單胞菌重組蛋白POP及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201610118248.7
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105732818B
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 趙莉群;顧江;章金勇;鄒全明;楊峰;楊茜;彭六生;吳翼;王逸麟
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;A61K39/104;A61P31/04;G01N33/569
• 代理公司: 重慶志合專利事務所(普通合伙) 50210
• 代理人: 胡榮琿

本發明提供了一種銅綠假單胞菌重組蛋白POP及其制備方法和應用，由銅綠假單胞菌III型分泌系統組件蛋白PcrV片段、銅綠假單胞菌外膜脂蛋白OprI片段以及銅綠假單胞菌IV型菌毛蛋白PilA片段依次通過連接肽(linker)連接形成的重組蛋白，所述重組蛋白具有通式：PcrV片段?(Linker A)_m?OprI片段?(Linker B)_n?PilA片段；其中，所述Linker A和Linker B序列分別獨立地選自GGGGS、GGSGG、YAPVDV中的一個；m和n分別獨立地取值為1、2、3或4。本發明還提供了上述重組蛋白的制備方法和應用。利用本發明的重組蛋白制備的亞單位疫苗可激發機體產生高滴度IgG抗體，可用于診斷、預防或治療藥物的制備。

技術領域

本發明屬于生物技術制藥領域，涉及一種銅綠假單胞菌重組蛋白POP，本發明進一步涉及該重組蛋白的制備方法及其在制備疫苗和檢測試劑盒中的應用。

背景技術

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗稱綠膿桿菌，為非發酵菌中的假單胞菌屬，廣泛分布于自然界、正常人皮膚、腸道、呼吸道中，在醫院病房及醫療器械中也普遍存在，是臨床上最為常見的條件致病菌之一。目前在全球范圍內，該菌已成為ICU病房、燒傷、戰創傷感染，機械通氣相關肺炎(VAP)分離率最高的病原菌之一。PA感染可發生在人體任何部位和組織，如燒傷或創傷部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道等，也可引起心內膜炎、胃腸炎、肺炎甚至敗血癥等全身感染，全身感染死亡率超過20％。

此外，由于抗生素的濫用等原因，PA的耐藥問題逐漸突出，出現了泛耐藥銅綠假單胞菌(PDR-PA)和多重耐藥銅綠假單胞菌(MDR-PA)，且耐藥性PA的分離率逐年上升。中國CHINET2005--2012年連續監測資料顯示，PA對常用抗菌藥物的耐藥率保持在較高水平，但略呈下降趨勢。如亞胺培南的年度耐藥率分別為31.0％、42.8％、35.8％、30.5％、30.5％、30.8％、29.1％和29.1％，對美羅培南的年度耐藥率分別為32.0％、34.1％、28.5％、24.5％、25.2％、25.8％、25.0％和27.1％，但其中泛耐藥(PDR-PA)菌株數量顯著增多，在2011年和2012年分別達到1.8％和1.5％(銅綠假單胞菌下呼吸道感染診治專家共識，中華結核和呼吸雜志，2014年1月37卷1期)。由于PA在臨床上的高感染率和耐藥率的不斷攀升，尋找新的“非抗生素療法”迫在眉睫，從免疫學角度入手，研制開發出安全有效的疫苗成為最為理想的選擇。

基因工程亞單位疫苗通過基因工程的手段，將病原體的致病因子或其突變體的基因克隆至的蛋白表達載體，重組子在工程菌內進行大規模表達，經過純化后制備成基因工程亞單位疫苗。該疫苗具有工藝簡單、成本 低、可操作性強等有點，已成為疫苗研發的重要方向。研發基因工程疫苗的關鍵是篩選到良好的保護性抗原分子。

銅綠假單胞菌的III型分泌系統是由20多個蛋白質組成的注射器樣的大復合物，能夠將一些毒力因子(如ExoU、ExoS、ExoY、ExoT等)及其它效應蛋白直接注入宿主細胞，引起宿主細胞損傷從而在細菌感染性疾病中發揮重要作用。PcrV是銅綠假單胞菌III型分泌系統的重要組件之一，它能夠形成同源多聚體，組裝成分泌系統運輸毒力因子和效應蛋白的“管道”，是銅綠假單胞菌III型分泌系統的關鍵組件(Teiii S.等，Critical Care2014)。鑒于PcrV在銅綠假單胞菌致病中的重要作用，該蛋白已成為銅綠假單胞菌感染治療性抗體針對的重要靶標。抗PcrV的多克隆抗體、單克隆抗體都能夠抑制III型分泌系統的分泌，保護機體受到銅綠假單胞菌的入侵(Sawa，T.等.Nat Med 1999，Milla，C.E.等PediatrPulmonol 2014，Frank，D.W.等J Infect Dis 2002，Baer，M.等Infect Immun2009。同樣PcrV也是重要的候選疫苗分子，但由于其本身能夠形成同源多聚體等原因，目前還未見有可溶性重組表達該蛋白單體的報道。