[發明專利]一種基于抑制H3K9me3甲基化的提高豬克隆效率的方法

在審

• 申請號: 201610117566.1
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105543230A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 吳珍芳;李紫聰;李果;劉德武;蔡更元;鄭恩琴
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 高之波;李波

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及轉基因工程技術，具體涉及 一種提高豬克隆效率的方法。

背景技術

隨著克隆動物的大量生產，克隆的基本方法路線趨于定型和規范化， 但是目前克隆動物的生產效率依然很低，后代平均出生率不超過5％。低下 的克隆效率使得生產克隆動物的一直處于高投入低產出的困境，為研究和 應用帶來了一系列的問題。豬克隆技術已經建立超過14年時間，多種克隆 豬或基因修飾克隆豬已經被生產，但目前克隆豬的效率仍然十分低下，移 植的豬克隆胚胎在代孕母豬子宮內發育至出生的效率一般在1％左右。豬的 克隆效率低下主要表現在胚胎移植后流產率高，胎兒圍產期死亡率高以及 出生后的成活率低。影響豬克隆效率的因素有很多，如供體細胞的選擇， 供體細胞的傳代次數，卵母細胞的去核方法，融合、激活方式，供體細胞 核與卵質受體的同期化，重構胚的激活，胚胎培養條件優化以及Xist基因 異常表達等，但主要還是由于供體細胞核發生了錯誤或不完全重編程，而 重編程過程中主要是表觀遺傳修飾發生了變化，表觀遺傳修飾的一個重要 方面是組蛋白修飾，而組蛋白甲基化是組蛋白修飾的主要方式之一，是由 組蛋白甲基化轉移酶(histonemethyltransferase，HMT)完成的。H3組蛋 白第9賴氨酸3甲基化(H3K9me3)是眾多的染色質組蛋白修飾方式之一。 H3K9me3已被證明通過與異染色質蛋白1(HeterochromatinProtein1,HP1) 的互作，使H3K9me3所結合的染色質區域的構象改變，從而使該染色質區 域內基因的表達沉默。此外，H3K9me3還抑制能激活基因表達的兩種染色 質組蛋白修飾的建立，包括H3組蛋白第9賴氨酸乙酰化(H3K9ac)和H3 組蛋白第9賴氨酸甲基化(H3K9me)。因此，H3K9me3是一種抑制基因表 達的表觀遺傳修飾。

最近一些研究表明，豬體細胞中存在高水平的H3K9me3組蛋白甲基 化。這意味著在克隆胚胎中來源于供體細胞的高水平H3K9me3也可能是導 致豬克隆效率低下的重要原因，而擦除或抑制H3K9me3甲基化將有可能矯 正豬克隆胚胎的基因表達模式，從而顯著提高豬克隆胚胎的發育效率。

有報道表明在小鼠上Suv39H1和Suv39H2基因的主要功能是負責 建立H3K9me3的組蛋白甲基化酶；人或小鼠KDM4A、KDM4B、KDM4D 基因的mRNA主要功能是特異擦除H3K9me3的組蛋白去甲基化酶。但 在豬的研究方面未見相關報道，也未有報道表明通過抑制豬Suv39H1 和Suv39H2基因及注射KDM4A、KDM4B、KDM4D基因的mRNA來抑 制或擦除H3K9me3可以提高豬克隆效率。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于抑制H3K9me3甲基化的提高豬克隆效 率的方法，以提高豬克隆效率。

根據本發明的一個方面，提供了一種基于抑制H3K9me3甲基化的 提高豬克隆效率的方法，所述方法是通過抑制豬克隆胚胎核移植時供核 細胞中Suv39H1和Suv39H2基因的表達及在核移植重構胚中過表達 KDM4AmRNA來抑制H3K9me3甲基化，進而提高豬克隆效率的。具體的， 該基于抑制H3K9me3甲基化的提高豬克隆效率的方法通過在核移植前 先在供核細胞中共轉染抗Suv39H1和Suv39H2基因的有效siRNA，來抑制 供核細胞中Suv39H1和Suv39H2基因的高表達，從而抑制供核細胞中的 H3K9me3高甲基化水平，然后將處理后的供核細胞進行核移植，并在核移 植獲得的重構胚激活后，進行包漿顯微注射KDM4AmRNA進一步抑制重 構胚中組蛋白H3K9me3甲基化，以最終來提高豬的克隆效率。供核細胞中 高水平H3K9me3甲基化對克隆效率有很大影響，因此可以通過共轉染抗 Suv39H1和Suv39H2基因的有效siRNA來抑制Suv39H1和Suv39H2基因 的表達，進而實現快速抑制H3K9me3甲基化，但因為siRNA易降解，其 對H3K9me3的抑制是有時效性的，因此在核移植過程中，重構胚被激活后， 再通過包漿顯微注射KDM4AmRNA來進一步抑制H3K9me3甲基化，且 KDM4AmRNA不易降解，作用時間更加長久。本發明通過作用機理不同、 作用階段不同的兩種方式共同處理核移植過程中不同的時期，以達到更好 的抑制H3K9me3甲基化的效果，最終來提高豬克隆效率，其所述方法通過 以下步驟實現：