[發明專利]一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法

在審

• 申請號: 201610117535.6
• 申請日: 2016-03-02
• 公開（公告）號: CN105648025A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 徐天瑞;楊洋;劉瑩;王珍
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N15/62;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京國智京通知識產權代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是一種基于褪黑素受體2分 子探針的藥物活性成分篩選方法。

背景技術

常規的細胞水平、動物水平的藥物篩選方法不僅費時、費力，而 且容易受到多重因素的干擾，假陽性、假陰性率較高，也很難確定藥 物作用的靶點，并且需要大量的被篩選化合物。近十年來，隨著生物 檢測技術和計算機技術的快速發展，分子水平的藥物篩選方法不斷涌 現，如：表面等離子體共振法、核磁共振法、下游信號分子檢測法、 熒光偏振法、虛擬篩選法等等，每種方法有自己的優缺點，都屬于間 接的篩選方法。至今還沒有以受體空間構象變化為指針，可以直接、 實時監測受體對藥物反應的高靈敏度的篩選法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物 活性成分篩選方法，根據受體空間構象變化為指針，可以直接、實時 監測受體對藥物反應的高靈敏度的篩選法。

為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明公開了一種基 于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，篩選方法包括了 以下步驟：

步驟1:構建的褪黑素受體2分子探針:

A.用PCR的方法將VSV-Gtag及限制性內切酶位點分別引入人 褪黑素的cDNA的5’端,并用OverlappingPCR法將eCFP的cDNA 連接到受體cDNA的3’端，將“受體-eCFP”連接到pcDNA5/FRT/TO 載體，從而得到pcDNA5/FRT/TO-VSV-受體-eCFP質粒；

B.用突變法將eYFP熒光基團的cDNA接入質粒中受體第三內環 中，從而得原始的分子探針質粒；

C.用探針質粒轉染HEK293細胞48小時,以表達受體分子探針， 并用市售的受體激動劑激活探針，用Olympus高速熒光顯微鏡監測 探針的靈敏度；

D.根據探針靈敏度的監測結果，對探針進行結構優化；

步驟2：建立誘導表達G蛋白偶聯受體分子探針的Flp-InT-Rex HEK293細胞系：

A.將優化后的分子探針質粒和pOG44載體共轉染Flp-InT-Rex HEK293細胞,并用200ug/mlHygromycin篩選陽性細胞克隆；

B.用1ug/mlDoxycycline誘導細胞表達相應的G蛋白偶聯受 體分子探針，用VSV抗體檢測探針蛋白的表達，用熒光顯微鏡監測 分子探針的細胞定位；

C.用受體激動劑處理已經表達的受體分子探針Flp-InT-Rex HEK293細胞，得到不同激動劑劑量的受體激活的FRET曲線，并在停 止給藥后繼續用生理鹽水洗脫激動劑。

其中，步驟1中對探針進行結構優化具體如下：

褪黑素受體共有363個氨基酸殘基，將CFP熒光基團接于五羥色 胺受體C端第363氨基酸之后，調整eYFP基團在受體第三內環的位 置：將eYFP基團置于第238-239位氨基酸之間。

本發明具有以下有益效果：

1.本發明采用熒光共振能量轉移的方法建立了褪黑素受體2分子探 針，該分子探針具有高靈敏度，低噪音，高通量的特點，不僅能篩選 受體激動劑也能篩選拮抗劑/反向激動劑，并且篩選過程不受下游信 號的干擾。

2.經過合理設計的分子探針能夠對中藥混合物進行篩選，能一步到位 的在受體水平上篩選到分子作用靶點明確的先導化合物。

附圖說明

圖1為本發明分子探針的結構示意圖。

圖2為本發明實施例2的結果示意圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合 附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。

實施例1

如圖1所示，本發明公開了一種基于褪黑素受體2分子探針的藥 物活性成分篩選方法，篩選方法包括了以下步驟：

步驟1:構建的褪黑素受體2分子探針:

A.用PCR的方法將VSV-Gtag及限制性內切酶位點分別引入人 褪黑素的cDNA的5’端,并用OverlappingPCR法將eCFP的cDNA 連接到受體cDNA的3’端，將“受體-eCFP”連接到pcDNA5/FRT/TO 載體，從而得到pcDNA5/FRT/TO-VSV-受體-eCFP質粒；