[發明專利]一種烏桕莖尖玻璃化超低溫保存的方法

有效

• 申請號: 201610115584.6
• 申請日: 2016-03-01
• 公開（公告）號: CN105519522B
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發明（設計）人: 侯金艷;吳麗芳;穆燕;趙華
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00
• 代理公司: 合肥市浩智運專利代理事務所(普通合伙)34124
• 代理人: 丁瑞瑞

1.一種烏桕莖尖玻璃化超低溫保存的方法，其特征在于，依次包括：烏桕莖尖剝取、預培養、裝載、玻璃化處理、小液滴制作、超低溫冷凍保存、卸載和恢復培養的步驟；

所述的預培養是指：將剝取的莖尖接種于添加有0.2-0.5M蔗糖的MS固體培養上，于25±2℃的恒溫培養室黑暗培養1-5d；

所述的裝載具體是指：將預培養后的離體莖尖轉接于裝載液中，于室溫下裝載處理10-60min；所述的裝載液的組成為：MS+2M甘油+0.4M蔗糖；

所述的玻璃化處理具體是指：將裝載處理后的莖尖轉接于PVS2溶液中，于0℃處理1-4h；所述的PVS2溶液的組成為：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亞砜+0.4M蔗糖；

所述的卸載是指：將超低溫冷凍保存的離體莖尖取出，放置于卸載液中進行解凍和洗滌；所述的卸載液的組分為：MS+1.2M蔗糖；所述的卸載和洗滌條件為：室溫下洗滌莖尖2-3次，每次洗滌時間5-10min；

所述的恢復培養具體是指：將卸載處理后的離體莖尖用無菌濾紙吸干表面殘留液，轉接于恢復培養基中進行恢復培養；所述的恢復培養基為MS+0.5-2.0mg/L6-BA+3％蔗糖+0.7％瓊脂，pH＝5.8；所述的恢復培養條件為：25±2℃的恒溫培養室黑暗培養7d,最后轉至光照強度為40μmolm^-2s^-2,光照時間為14h的條件下進行植株再生。

2.根據權利要求1所述的一種烏桕莖尖玻璃化超低溫保存的方法，其特征在于，所述的烏桕莖尖剝取具體是指：在無菌條件下，從烏桕植株莖段誘導的不定芽叢上剝取帶有2-3個葉原基，直徑大小約為2-3mm的離體莖尖。

3.根據權利要求1所述的一種烏桕莖尖玻璃化超低溫保存的方法，其特征在于，所述的小液滴制作具體是指：將PVS2處理后的莖尖轉移到鋁箔條上,并向每個莖尖滴加8-10μLPVS2溶液，使莖尖完全包裹于PVS2小液滴中，每個錫箔條上放5-6個莖尖。

4.根據權利要求1所述的一種烏桕莖尖玻璃化超低溫保存的方法，其特征在于，所述的超低溫冷凍保存具體是指：將上述制作好的含有小液滴的錫箔條直接浸入液氮中進行冷凍，然后將冷凍后的錫箔條置于2ml冷凍離心管中，蓋緊蓋子后，投入液氮中保存。