[發明專利]一種體外皮膚模型及角質形成細胞長效培養液

有效

• 申請號: 201610114508.3
• 申請日: 2016-03-01
• 公開（公告）號: CN105602890A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 支旭勃;張小波;盧永波
• 申請（專利權）人: 陜西博溪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，涉及一種體外皮膚模型及角質形成細胞長效培養液。

背景技術

體外皮膚模型是應用組織工程技術在體外通過對種子細胞的條件化培養而構建而成的一塊皮膚組織，該組織與人體皮膚在組織結構及部分生物學功能上有著高度的相似性，因此被廣泛應用于化妝品、藥品等產品及原料的功效性和安全性評價、檢測。目前常見的體外皮膚模型有：表皮模型，含真皮層、表皮層的全層皮膚模型，含有黑色素細胞的表皮模型等。

市售的體外皮膚模型在構建完成后，直接保存在構建培養液中，其宣傳的使用期限多以3天為主，但都推薦在模型構建完成后24小時內使用，因為皮膚模型為活細胞產品，會持續生長、分化，長時間的增殖分化必然會改變皮膚模型的結構及生物學功能，從而導致測試結果不準確；另外，根據某些測試目的的不同，需要延長模型的培養、處理時間，仍難以避免出現上述問題。構建培養液的培養體系僅能支持皮膚模型正常生發，但無法滿足構建完成后的皮膚模型維持結構及生物學特性，因此開發一種可以用于體外皮膚模型培養、保存用的培養液意義重大。

角質形成細胞是表皮中的主要細胞，具有干細胞特性，能在不同培養條件刺激下分化成表皮基底層細胞、棘層細胞、顆粒層細胞及角質層細胞，形成與正常表皮結構高度一致的四層結構。一般體外皮膚模型構建成功后的測試培養周期不超過3天就會出現活力下降及組織過度分化的現象。正常分離出來的角質形成細胞多采用K-SFM培養液進行培養，在體外擴增傳代不超過10代就會出現老化，甚至死亡的現象，尤其是在含血清的培養體系中，其老化死亡速度更快。

為延緩或重新恢復角質形成細胞的增殖、分化能力，保證體外皮膚模型結構及活力滿足測試要求，唯有通過表皮細胞的去分化技術。一類是通過轉基因技術給已分化細胞通過病毒轉染體系轉入oct4，sox2，C-Myc及klf44種基因，經過體外誘導使終末分化細胞重新具有干細胞特性，即誘導多功能干細胞（iPSCell）；另一類是通過非轉基因技術，通過核移植、體細胞克隆，過氧化氫處理及熱刺激等方法使細胞去分化。但上述方法僅限于理論研究，技術難度較大，會導致成本倍增，不利于產業化操作，而且處理方法會對構建的模型產生損傷，造成模型測試結果的不準確。

針對以上問題，學者們通過研究發現，改變表皮細胞所處的微環境，有可能使已分化細胞去分化而逆轉成表皮干細胞，例如，通過給培養液中添加表皮細胞生長因子（EGF），堿性成纖維細胞生長因子（β-FGF），轉化生長因子（TGF）等多種因子，可以使分化的表皮細胞重新呈現干細胞特性。添加干細胞及腫瘤細胞提取液也能起到相似的作用。

通過上述處理，雖然能夠使已經發生分化的細胞重新呈現分化前的狀態，同時對老化及損傷的細胞的也有一定的復壯作用，從而保證體外皮膚模型繼續保持一定的增殖分化能力，但是在正常的培養液中，模型也會保持正常的生長速度，甚至更快，所以單純添加上述因子或含有上述因子的混合物并不能實現延長模型培養期限的目的，無法平衡增殖與分化之間的速度。

研究表明甘醇酸有促進表皮細胞增殖，溶解角質層，抑止表皮細胞過度分化，逆轉早期腫瘤細胞惡性等作用。研究表明低劑量1×10^-7M維甲酸可以顯著降低如K1，K10，K11等與表皮細胞分化有關的角蛋白的表達，能從一定程度上控制皮膚的過度分化，平衡增殖分化速度。

中國專利200810169475.8中提到通過改變熱刺激條件和生長因子干預的方法可使表皮細胞去分化轉變為表皮干細胞。該方法需對表皮細胞熱激處理后，然后在生長因子的作用下，繼續孵育培養7~14天，首先前期處理時間過長，對于體外皮膚模型的生產周期及成本會顯著增加；其次干細胞構建后期數量會急劇減少而得不到補充，不能從根本解決構建后期模型活力降低及過度分化的問題。

中國專利200910078302.X及201010196382.1中均提及，體外皮膚模型培養液系統僅限于皮膚模型的構建培養，用此類培養基，可保證體外皮膚模型生發成正常的結構，對于保存期間及正常使用期間的結構變化不能有效控制，而在此期間發生的模型屏障功能及其他精細結構的變化對模型測試結果的準確性又有很大的影響；對于需要長期培養、處理的體外皮膚模型，應用上述培養體系將會因組織活力下降、組織結構嚴重變化而無法實現。

目前還未見有一種培養液能夠支持含有表皮細胞的體外皮膚模型長效培養，因此本發明對延長體外皮膚模型應用時間，拓寬體外皮膚模型應用領域，以及表皮細胞相關疾病研究等方面有重要的意義。

發明內容