[發(fā)明專利]高效液相色譜法測(cè)定血漿及大腸癌細(xì)胞中5-氟尿嘧啶含量的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610112481.4
• 申請(qǐng)日: 2016-03-01
• 公開（公告）號(hào): CN105588912A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周杏琴;毛師師;鄒美芬;徐希杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;張仕婷

技術(shù)領(lǐng)域

高效液相色譜法進(jìn)行血漿及大腸癌細(xì)胞中5-氟尿嘧啶含量的測(cè)定方法，屬于液相 色譜醫(yī)學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

5-氟尿嘧啶(5-Fu)是目前在臨床上應(yīng)用最廣泛的嘧啶類抗腫瘤藥物，常用于大腸 癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤的治療。但是臨床上不同的腫瘤患者對(duì)5-Fu的療效和毒性反應(yīng)有 明顯的個(gè)體差異。其抗癌化療效應(yīng)和癌細(xì)胞內(nèi)該藥物濃度有很大的關(guān)系，而且該藥在體內(nèi) 藥物濃度過(guò)高時(shí)會(huì)發(fā)生其它的副作用。為了增強(qiáng)藥物的療效和減少不良副作用，必須嚴(yán)格 監(jiān)測(cè)其在癌細(xì)胞內(nèi)的濃度及體內(nèi)藥物濃度的動(dòng)態(tài)。進(jìn)行監(jiān)測(cè)對(duì)提高藥物療效，降低毒性，防 止術(shù)后轉(zhuǎn)移具有較大的臨床意義。

雖然文獻(xiàn)已有報(bào)道采用HPLC法測(cè)定5-Fu，但5-Fu小腸吸收差，口服生物利用度低， 細(xì)胞及血漿中藥物含量極低，加上細(xì)胞及各血漿內(nèi)源性物質(zhì)干擾大，萃取方法回收率偏低， 采用常規(guī)的測(cè)定方法難以達(dá)到所需的檢測(cè)靈敏度，因而影響生物樣本中5-Fu測(cè)定的準(zhǔn)確 性。

本發(fā)明采用固相萃取提取大腸癌細(xì)胞及血漿中的5-Fu，提高了5-Fu的萃取效率； 并對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，文獻(xiàn)[1：劉放，劉雪莉，周芝芳等，用HPLC法測(cè)定5-Fu在大腸癌細(xì) 胞中的吸收特性，腫瘤研究與臨床，2002，14（3）：155-158.]HPLC測(cè)定5-Fu，色譜條件采用磷 酸鹽緩沖液體系，色譜峰存在嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象；而且純粹的磷酸鹽體系對(duì)色譜柱和進(jìn)樣體系 影響較大，大大縮短其使用壽命；本發(fā)明通過(guò)在檢測(cè)流動(dòng)相中添加三氟乙酸和甲醇體系改 善了峰型，提高了理論塔板數(shù)并使色譜條件溫和，在選定的最佳色譜條件下，使5-Fu的測(cè)定 比文獻(xiàn)報(bào)道的更加精密、準(zhǔn)確。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用高效液相色譜法進(jìn)行血漿及大腸癌細(xì)胞中5-氟尿嘧 啶含量的測(cè)定方法。本發(fā)明采用固相萃取提取大腸癌細(xì)胞及血漿中的5-Fu，提高了5-Fu的 萃取效率；并對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，使5-Fu的測(cè)定比文獻(xiàn)報(bào)道的更加精密、準(zhǔn)確。

本發(fā)明的技術(shù)方案：高效液相色譜法測(cè)定血漿及大腸癌細(xì)胞中5-氟尿嘧啶含量的 方法，步驟為：

（一）、生物樣本前處理

血漿樣品處理

將固相萃取柱StyreScreen?HP依次用1mL乙醇、1mL含0.1%三氟乙酸的去離子水活 化；

吸取0.5mL血漿樣品，以1mL/min的速度加入活化后的固相萃取柱，待樣品富集后用1mL 去離子水淋洗，抽干；用V/V為75︰25的乙醇-含0.1%三氟乙酸的去離子水溶液洗脫，抽干；使 用真空離心蒸發(fā)濃縮器干燥20min，去掉有機(jī)溶劑；經(jīng)冷凍干燥器干燥濃縮，測(cè)定時(shí)用流動(dòng) 相稀釋到合適的濃度；

大腸癌細(xì)胞（SW480-B7及SW480-NC）樣品處理

將固相萃取柱StyreScreen?HP依次用1mL乙醇、1mL含0.1%三氟乙酸的去離子水活 化；

分別取大腸癌細(xì)胞SW480-B7及SW480-NC，細(xì)胞數(shù)1×10⁶，加質(zhì)量濃度0.1%的氫氧化鈉 溶液1mL，超聲5min后，加0.5g硫酸銨，超聲5min后，吸取0.5mL超聲處理后的溶液，以1mL/ min的速度加入活化過(guò)的固相萃取柱，待樣品富集后用1mL去離子水淋洗，抽干；用V/V為75︰ 25的乙醇-含0.1%三氟乙酸的去離子水溶液洗脫，抽干；使用真空離心蒸發(fā)濃縮器干燥 20min，去掉有機(jī)溶劑；經(jīng)冷凍干燥器干燥濃縮，測(cè)定時(shí)用200μL流動(dòng)相溶解；

流動(dòng)相為：磷酸調(diào)pH=3.0、再用三氟乙酸調(diào)pH=2.0的去離子水-甲醇溶液，去離子水︰甲 醇體積比95︰5，使用前經(jīng)0.45μm濾膜抽濾并脫氣；

（二）、色譜條件

色譜條件確定為：儀器：Waters1525型高效液相色譜儀，2489紫外檢測(cè)器；色譜柱 DiamonsilC18柱，5μm、4.6×250mm；

流動(dòng)相：磷酸調(diào)pH=3.0、再用三氟乙酸調(diào)pH=2.0的去離子水-甲醇溶液，去離子水︰甲醇 體積比95︰5，使用前經(jīng)0.45μm濾膜抽濾并脫氣；

流速：1mL/min；

進(jìn)樣體積：20μL；

柱溫：30℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：266nm；

（三）、固相萃取柱的選擇

采用StyreScreen?HP固相萃取柱；