[發明專利]一種新型隱球菌莢膜多糖GXM的制備方法

在審

• 申請號: 201610112390.0
• 申請日: 2016-02-29
• 公開（公告）號: CN105784987A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 彭潔;史東東;李寧;粟艷;周澤奇
• 申請（專利權）人: 丹娜（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N30/02;G01N21/31
• 代理公司: 北京布瑞知識產權代理有限公司 11505
• 代理人: 張丹

技術領域

本發明涉及抗原制備領域，具體涉及一種新型隱球菌的莢膜多糖GXM 的制備方法。

背景技術

新型隱球菌(CrytococcusNeofonmans)，又名溶組織酵母菌(Torula Histolytica)，可在土壤、鳥糞、尤其是鴿糞中大量存在，也可存在于人體 的體表、口腔及糞便中，可侵犯人和動物引起隱球菌病，對人類而言，它通 常是條件致病菌，不僅能感染免疫抑制患者，也能感染免疫正常人群，大多 由呼吸道吸入后引起感染，在肺部引起輕度炎癥，肺部感染一般預后良好。 當機體免疫功能下降時可向全身播散，播散病灶可發生再各個臟器，最易侵 犯中樞神經系統，引起隱球菌性腦膜炎。隱球菌性腦膜炎是一種預后嚴重的 深部真菌感染，早期誤診率達90％，死亡率和嚴重病殘率分別高達25％～60％ 和20％以上(廖萬清,姚志榮,顧菊林,等.隱球菌性腦膜炎的診斷與治療. 傳染病信息，2000，13(2)：86)。

新型隱球菌的主要致病因素為莢膜、產黑素及其在宿主體溫環境生長的 能力等，其中莢膜為其毒性的主要決定因子之一，其主要成分是莢膜多糖， 具有抑制吞噬和激活補體的作用，其中含量最多的是葡萄糖醛酸木糖甘露聚 糖(GXM)。在隱球菌性腦膜炎的早期診斷方法上，Wang等采用乳膠凝集 試驗檢測隱球菌莢膜多糖抗原，用真菌培養和直接鏡檢法評估診斷的靈敏度 和特異性，結果發現乳膠凝集試驗、真菌培養和直接鏡檢的靈敏度分別為 91.1％、69.6％和73.2％，特異性分別為96.0％、100％和100％，由此認為乳 膠凝集試驗檢測隱球菌莢膜多糖抗原可作為對新型隱球菌性腦膜炎早期診 斷方法。對隱球菌性腦膜炎進行隱球菌乳膠凝集試驗對診斷隱球菌性腦膜炎 特異性高，使早期診斷率得以提高(WangH,YuanX,ZhangL.Latex agglutination:Diagnosetheearlycryptococcusneoformanstestofcapsular polysaccharideantigen.Pakistanjournalofpharmaceuticalsciences,2015,28(1 Suppl):307-311.)。因此，新型隱球菌莢膜多糖對隱球菌性腦膜炎的早期診 斷非常重要。

Kozel等用培養罐培養新型隱球菌，培養液經過高壓滅菌后，離心除去 菌體，上清液先用0.45um濾膜過濾，然后超濾濃縮，并向濃縮液中加入醋 酸鈉和冰醋酸，接下來用乙醇沉淀出粗制莢膜多糖，然后用氯仿/正丁醇(v:v ＝5:1)進行反復抽提，除去蛋白，再用乙醇將莢膜多糖沉淀出來，離心收集 沉淀，將沉淀溶于去離子水，透析，凍干得到精制莢膜多糖(KozelTR,Cazin J.NonencapsulatedvariantofCryptococcusneoformansI.Virulencestudiesand characterizationofsolublepolysaccharide.Infectionandimmunity,1971,3(2): 287-294.)。上述方法中需使用大量的氯仿，氯仿是有毒有害的化學危險品， 有致癌的危險性，對工作條件、操作人員的保護、污水處理等有較高要求。

Bryan等將新型隱球菌細胞用蒸餾水洗滌3次，離心收集細胞，用15mL 二甲基亞砜(DMSO)重懸收集的濕細胞并孵育30分鐘，然后通過離心將 細胞沉淀分離，將DMSO上清液透析12小時，每2小時用水置換，得到的 樣品用蒸餾水或1mMEDTA充分透析3天，將透析得到的多糖溶液冷凍干 燥得到莢膜多糖(BryanRA,ZaragozaO,ZhangT,等.Radiologicalstudies revealradialdifferencesinthearchitectureofthepolysaccharidecapsuleof Cryptococcusneoformans.EukaryoticCell,2005,4(2):465-475.)。上述方法 的制備周期較長，產品的產率不高。