[發(fā)明專利]一種玉米赤霉烯酮免疫親和柱及其制備方法和用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610112233.X
• 申請日: 2016-02-29
• 公開（公告）號(hào): CN105771937A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅曉琴;馮靜;萬宇平;何方洋;徐念琴;朱亮亮;崔海峰;齊向武
• 申請（專利權(quán)）人: 北京勤邦生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): B01J20/281
• 分類號(hào): B01J20/281;B01J20/30;B01D15/38;G01N1/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于谷物和飼料中真菌毒素殘留檢測分析技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種 玉米赤霉烯酮的免疫親和層析柱及其制備方法和用途。

背景技術(shù)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)為一種白色結(jié)晶，又稱F-2毒素，是由禾谷鐮刀菌等菌 種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。1962年Stob等首先從發(fā)霉的玉米中分離得到了該毒素，命名為玉米 赤霉烯酮。

ZEN主要污染玉米、高粱、小麥、大麥等糧谷類作物及其制品如飼料等。Toshitsugu對(duì)19 個(gè)國家和地區(qū)的谷物、食品及飼料中所含的ZEN進(jìn)行了調(diào)查發(fā)現(xiàn)，包括中國、阿根廷、加拿 大、波蘭及也門等眾多國家和地區(qū)的樣品均有不同程度的污染。借助被污染的乳制品、肉制 品等動(dòng)物源性食品，ZEN及其代謝產(chǎn)物可以進(jìn)入人體，給人類的健康造成威脅。ZEN對(duì)動(dòng)物 及人類危害主要表現(xiàn)在影響和破壞生長發(fā)育及生殖系統(tǒng)方面，人畜誤食含有該毒素的食物后， 會(huì)引起雌性激素中毒癥。造成生殖系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。此外，ZEN及其衍生物對(duì)肝臟系統(tǒng)，免 疫系統(tǒng)均有很大的危害，并且有引發(fā)腫瘤的可能性。SchoentalR在進(jìn)行致癌試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，試 驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)由致癌劑處理而誘發(fā)的腫瘤；此外，試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠還發(fā)生了乳腺纖維瘤、 腺瘤、腺癌、垂體腺癌、睪丸間質(zhì)腫瘤以及子宮纖維瘤等。在其他致癌試驗(yàn)中也有類似情況 發(fā)生，這些腫瘤所涉及的器官表明，它們可能與動(dòng)物飼料中的雌激素物質(zhì)有關(guān)。因此認(rèn)為， 它們是由污染飼料的ZEN或其代謝產(chǎn)物引起的。

玉米赤霉烯酮的分析測定一般采用薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)和高效液 相色譜法(HPLC)。但是，目前所用的確證方法對(duì)樣品要求高，前處理復(fù)雜，限制了監(jiān)測的效 率。實(shí)際工作中，由于生物樣本的成分復(fù)雜，而且大多數(shù)取樣量很少，這對(duì)分析方法的特異 性和靈敏度提出了很高的要求。因此，有必要建立一種操作快捷，且具有很高的特異性和靈 敏度的方法。

免疫親和層析技術(shù)是一種即免疫反應(yīng)和層析技術(shù)相結(jié)合的分析方法，在提純物質(zhì)上是一 項(xiàng)效率高、提純物質(zhì)純度高、快速的技術(shù)，可以使免疫檢惻技術(shù)(如ELISA等)和層析技術(shù)在特 異性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補(bǔ)，避免了免疫分析法直接測定樣品的不足。

免疫親和柱是上個(gè)世紀(jì)90年代在分析領(lǐng)域中得到應(yīng)用的技術(shù)，但用免疫親和柱提取樣品 中的玉米赤霉烯酮未見報(bào)道。因此，本發(fā)明人通過大量試驗(yàn)，研制成功了一種具有高特異性 和靈敏度且操作快捷的玉米赤霉烯酮免疫親和柱。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種快速提取玉米赤霉烯酮的免疫親和柱及其制備方法和用途。

本發(fā)明的原理是根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)和可解離的特性，用玉米赤霉烯酮抗體提取 谷物和飼料中的玉米赤霉烯酮?dú)埩簟?

一方面，本發(fā)明提供了一種制備玉米赤霉烯酮免疫親和柱的方法，該方法包括下列步驟：

該方法包括下列步驟：

a)稱取CNBractiveSepharose4B柱料1g，加入1mMHCl溶液10ml，浸泡30min，使之溶 脹。

b)然后以3000～8000r/min轉(zhuǎn)速離心2～10min分離柱料，用0.1MPH9.0CB緩沖液洗滌溶 脹的基質(zhì)3～5次，每次加入緩沖液10ml，以5000r/min離心10min分離柱料。

c)向溶脹好的柱料中加入抗體30mg，再加入0.1MPH9.0CB緩沖液10ml，于37℃條件 下150r/min震蕩反應(yīng)1h。

d)離心分離柱料，用0.1MPH8.3NaHCO₃緩沖液洗柱料3～5次，10ml/次。

e)加入含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl溶液10ml于結(jié)合有抗體的柱料中，4℃過夜 或者37℃，150r/min反應(yīng)2h封閉未結(jié)合位點(diǎn)。

f)用含0.5MNaCl的0.1MPH4.0的醋酸鈉洗脫液與含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl 溶液交替洗滌3～5遍，最終用含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl洗脫液10ml復(fù)溶。

g)按每支1ml抗體結(jié)合凝膠溶液進(jìn)行裝柱，加20％的乙醇保存液，4～8℃，可保存一年以 上。